甘草成分作為心臟保護(hù)液添加劑延長(zhǎng)大鼠供心冷缺血時(shí)間及機(jī)制研究.pdf

1、心臟移植作為終末期心衰最有效的治療手段，一方面能使患者的生存率顯著提高，延長(zhǎng)患者壽命，同時(shí)，可以使患者的生活質(zhì)量得到明顯改善。然而，由于供心數(shù)量的嚴(yán)重匱乏，為心臟移植手術(shù)的開展造成極大的障礙。因此，采取適當(dāng)方式來(lái)延長(zhǎng)供心的冷缺血時(shí)間，是擴(kuò)大供心獲取半徑和增加供心數(shù)量的可能途徑。研究表明，供心的保護(hù)效果極大影響著移植后供心的功能，影響患者的預(yù)后。因此，尋找更佳的供體心臟保存方法以延長(zhǎng)供心冷缺血時(shí)間就顯得尤為重要。
　　HTK液（Hi

2、stidine-tryptophane-ketoglutarate solution，組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽液）是目前廣泛應(yīng)用的離體器官冷藏保護(hù)液，可代償心肌細(xì)胞酸中毒和延長(zhǎng)無(wú)氧糖酵解時(shí)間，具有良好的心肌保護(hù)作用。近年來(lái)，臨床研究表明, HTK液雖然有很好的心肌保護(hù)作用，但是仍然不能完全保證心臟移植手術(shù)的成功，主要是因?yàn)樾呐K移植手術(shù)的過(guò)程中會(huì)發(fā)生缺血/再灌注(I/R)損傷。因此，探索更有效的預(yù)防心肌缺血/再灌注損傷的心肌保護(hù)方法和研

3、制新型心臟保護(hù)液配方是研究的熱點(diǎn)。
　　在我國(guó)傳統(tǒng)中藥寶庫(kù)中，很多中藥都有很好的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，這使在中藥中篩選出一種減輕心肌1/R損傷的中藥成為了可能。研究表明甘草具有很多藥理學(xué)活性，如抗心肌缺血、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和抗炎作用等。在我們的以前研究中發(fā)現(xiàn)，甘草中多種化合物，如甘草查爾酮B(LCB)、甘草查爾酮C(LCC)、山奈酚(Kae)和迷迭香酸(RosA)等，均有很好的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，并且這些化合物均能

4、顯著減輕心肌I/R損傷。
　　通過(guò)我們的研究結(jié)果，以及相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，我們推斷甘草提取物可作為傳統(tǒng)HTK液的添加劑，可能有增強(qiáng)心臟保護(hù)液對(duì)心肌的保護(hù)作用，從而延長(zhǎng)供心冷缺血時(shí)間。因此，我們?cè)趥鹘y(tǒng)HTK液中分別添加RosA、Kae、LCB和LCC，形成4種新的心臟保護(hù)液，并通過(guò)大鼠供心冷缺血模型、供心心臟移植模型及大鼠心肌缺血/再灌注模型，觀察其對(duì)心肌超微結(jié)構(gòu)改變和移植術(shù)后大鼠生存率、心功能影響，選出增強(qiáng)HTK液功效最有效的藥物，以

5、及對(duì)新型HTK液通過(guò)干擾PPAR-γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ）/NF-κB的途徑減輕冷缺血損傷的作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　第一部分:甘草提取物延長(zhǎng)供心冷缺血時(shí)間的研究
　　目的：
　　以離體大鼠的供心為研究對(duì)象，通過(guò)建立供心冷缺血保存模型和心臟移植模型完成供心的灌注、保存及移植，觀察含有不同甘草提取物成分的HTK液的

6、心肌保護(hù)效果。
　　方法：
　　將500只雄性近交系SD大鼠隨機(jī)分為供體組400只、受體組100只。供體組隨機(jī)分為4組，即冷缺血4h組、6h組、8h組、10h組，每組再隨機(jī)分為5小組，即HTK液組、RosA組（含有15μmol/L RosA的HTK液）、Kae組（含有15mmol/L Kae的HTK液）、LCB組（含有1μg/L LCB的HTK液）及LCC組（含有2mmol/L LCC的HTK液），每小組20只。受體組也隨機(jī)

7、分為4大組，每組再隨機(jī)分為5小組，每小組5只。供體組400只大鼠在全麻手術(shù)下切取供心。各供心組大鼠心臟使用該組對(duì)應(yīng)的含藥HTK液(4℃)進(jìn)行灌流停搏，心臟停搏后，立刻切取下，分別置于5種4℃的HTK液中保存4h、6h、8h、10h。冷缺血保存后，對(duì)供心進(jìn)行再灌注并檢測(cè)相關(guān)心功能指標(biāo)（射血分?jǐn)?shù)）。HE染色觀察心肌組織學(xué)結(jié)構(gòu)損傷，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。同時(shí)，在不同冷缺血時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)各組心臟保護(hù)液中肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌

8、鈣蛋白Ⅰ(CTnⅠ)的含量;檢測(cè)移植術(shù)后供心射血分?jǐn)?shù)及大鼠存活率;2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色估計(jì)心肌梗死而積。
　　結(jié)果：
　　1、隨冷缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，5種不同HTK液中心肌梗死面積逐漸升高，并且HTK液中的心肌酶（CK-MB和CTnⅠ）含量也逐漸升高。供心冷缺血時(shí)間6h以內(nèi)，5種不同HTK液中心臟損傷數(shù)據(jù)沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。供心冷缺血時(shí)間大于6h時(shí)，RosA組與Kae組心肌損傷程度均顯著低于HT

9、K液組（P＜0.05），主要表現(xiàn)為:RosA組與Kae組中心肌梗死面積和HTK液中心肌酶的含量均顯著低于HTK液組(P＜0.05)。
　　2、心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的比較:供心冷缺血時(shí)間6h以內(nèi)，在光鏡下各組心肌細(xì)胞形態(tài)基本保持正常，細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)輕度水腫，肌原纖維排列整齊，有少許溶解;供心冷缺血時(shí)間超出6h以上時(shí)，細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)中度水腫，部分纖維斷裂、溶解。與HTK液組相比，RosA組與Kae組心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕。
　

10、　3、心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化的比較:供心冷缺血時(shí)間6h以內(nèi)，電鏡下各組心肌細(xì)胞膜基本完整，細(xì)胞基質(zhì)輕度腫脹，肌絲、肌節(jié)結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，細(xì)胞核無(wú)腫脹，染色質(zhì)均勻，核周無(wú)水腫帶;供心冷缺血時(shí)間大于6h時(shí)，心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的損傷，少量心肌細(xì)胞有自溶現(xiàn)象出現(xiàn)，肌絲、肌節(jié)排列欠整齊，存在不同程度的紊亂，并開始出現(xiàn)空泡樣變。RosA組顯示出與其他組相比更好的心肌保護(hù)作用。
　　4、心肌梗死面積的檢測(cè):以供心冷缺血時(shí)間8 h TTC染色為代表

11、，HTK液組顯著高于RosA組，高于Kae組、LCB組及LCC組。
　　5、受體大鼠生存率的比較:供心冷缺血時(shí)間6h以內(nèi)，各組大鼠2個(gè)月生存率無(wú)明顯差別。當(dāng)供心冷缺血時(shí)間大于6h，與HTK組相比，RosA組大鼠生存率顯著提高（P＜0.05），并且RosA組大鼠的心臟射血分?jǐn)?shù)也顯著高于HTK液組(P＜0.05)。
　　6、供心心功能的比較。與HTK組相比，RosA組在早期再灌注階段顯著改善心功能（心臟射血分?jǐn)?shù)）(p＜0.01)

12、。添加Kae和LCB的HTK液也提高了心肌保護(hù)的效應(yīng)(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、隨冷缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌損傷逐漸加重，移植后供心射血分?jǐn)?shù)下降，大鼠生存率降低。
　　2、RoaA作為HTK液添加劑，具有延長(zhǎng)心肌冷缺血時(shí)間、減輕心肌損傷、提高移植后心臟的射血分?jǐn)?shù)及大鼠生存率。
　　3、RosA組心肌保護(hù)液效果優(yōu)于傳統(tǒng)HTK液組和其他添加劑組。
　　第二部分 迷迭香酸心肌保護(hù)作用機(jī)制研究
　　目

13、的：
　　探討迷迭香酸(RosA)作為HTK液添加劑增強(qiáng)心肌保護(hù)的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　成年SD大鼠隨機(jī)分為六組，假手術(shù)組（Sham組）、冷缺血/再灌注損傷組（I/R組）、RosA組、GW組(GW組，GW9662是PPAR-γ的選擇性阻斷劑)、RosA+冷缺血/再灌注損傷組（RosA+I/R組）、RosA+GW9662+冷缺血/再灌注損傷組（RosA+GW+I/R組）。在冷缺血保存4小時(shí)后，鼠心通過(guò)Lange

14、ndorff灌流系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)灌。血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)由生物多導(dǎo)記錄儀檢測(cè);測(cè)定灌注前后冠狀動(dòng)脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)含量。灌注結(jié)束，心肌梗死面積用TTC染色進(jìn)行檢測(cè);心肌組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物的比率(GSH/GSSG)用ELISA法測(cè)定;PPAR-γ和NF-κB的蛋白質(zhì)的表達(dá)量通過(guò)Wes

15、tern blot法進(jìn)行測(cè)定;心肌細(xì)胞凋亡率通過(guò)TUNEL法檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　與假手術(shù)組比較，I/R組心臟血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)均顯著降低，心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡率均顯著增加，冠脈流出液中的LDH和CK含量顯著升高，心肌組織中MDA、CRP、IL-6和TNF-α含量顯著升高，而SOD的活性顯著性降低。RosA和GW組與假手術(shù)組之間沒(méi)有顯著性差異。與I/R組相比，RosA+I/R組中心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡率、心肌組織中S

16、OD活性，GSH/GSSG比率和心臟血流動(dòng)力學(xué)系數(shù)顯著升高，冠狀動(dòng)脈流出液中心肌酶含量降低，心肌組織中MDA、CRP、IL-6和TNF-α的含量也顯著降低。并且PPAR-γ的蛋白表達(dá)量顯著性升高，而NF-κB的蛋白表達(dá)量顯著降低。重要的是，RosA的上述效應(yīng)幾乎全部被共同添加的GW9662逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論：
　　1、心臟經(jīng)冷缺血保存4h后，再灌注損傷表現(xiàn)為心肌收縮功能下降、心肌組織壞死加重、氧化應(yīng)激水平升高、炎癥因子分泌增加