ZIC1基因聯(lián)合苦參堿對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移及凋亡的影響研究.pdf

1、背景與目的：乳腺癌作為女性面臨的重大威脅，當(dāng)今對之采取的主流治療手段還是以手術(shù)為基礎(chǔ)的放化療聯(lián)合治療，考慮到其帶來的各類嚴重的副反應(yīng)或并發(fā)癥，傳統(tǒng)中藥以及靶向基因結(jié)合治療越來越為人們所重視和接受。本實驗探討ZIC1基因聯(lián)合苦參堿對高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖能力、黏附能力、遷移能力及凋亡的影響，進而為乳腺癌的治療探索新思路。
　　方法：1.首先將慢病毒載體pLV-Zic1-PGK-puro轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB

2、-231細胞株，轉(zhuǎn)染48小時后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，并培養(yǎng)篩選后得到穩(wěn)定傳代的細胞克隆。
　　2.以GAPDH作為內(nèi)參對照，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot法）檢測ZIC1基因轉(zhuǎn)染后在MDA-MB-231細胞中的表達。
　　3.之后以空載體轉(zhuǎn)染的人乳腺癌 MDA-MB-231細胞及 ZIC1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞作為研究對象進行細胞毒實驗。選取50，100，200，400，800mg/L濃度梯

3、度的苦參堿分別作用于空載體組與轉(zhuǎn)染組48h，四甲基唑藍法（MTT法）分別測量苦參堿對之作用后的生長抑制率，并篩選出苦參堿處理48h的半抑制濃度（IC50）。
　　4.以上述48h檢測出的IC50為苦參堿后續(xù)實驗的濃度，把細胞人為地劃分為四組，即A空載不加藥組（陰性對照組），B空載加藥組，C轉(zhuǎn)染不加藥組和D轉(zhuǎn)染加藥組。對四組細胞分別采用如下：（1）細胞黏附試驗及MTT法檢測細胞黏附能力，并計算各組細胞的黏附率；（2）細胞劃痕/遷移實

4、驗檢測細胞遷移能力，觀察各組細胞在24h，48h，72h下的遷移程度；（3）流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，分析各組細胞的凋亡率及凋亡分布情況。
　　結(jié)果：1.攜帶ZIC1基因的慢病毒載體pLV-Zic1-PGK-puro轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-231細胞，ZIC1在細胞中的表達情況：48h熒光顯微鏡檢測到大量綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染率達90％。
　　2.蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，ZIC1蛋白在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中均有表達，而在未轉(zhuǎn)染細胞均無表達。

5、
　　3.藥物的細胞毒實驗，經(jīng) MTT檢測，發(fā)現(xiàn)苦參堿對空載及轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細胞均呈現(xiàn)增殖抑制作用，具有劑量依賴性。其中，濃度為200mg/L的苦參堿作用于空載細胞、轉(zhuǎn)染細胞48h后細胞增殖抑制率分別為49.21%和52.42%左右，抑制率最接近50%。于是我們選取200mg/L濃度的苦參堿，作為后續(xù)的標(biāo)準實驗濃度。
　　4.在細胞黏附實驗中，MTT測得200mg/L苦參堿處理各組細胞48h后，轉(zhuǎn)染不加藥組（64

6、.13%）和空載加藥組（49.17%）的細胞黏附率均低于陰性對照組，而轉(zhuǎn)染加藥組細胞的黏附率約為31.23%，均明顯低于其余三組（P<0.05）；在細胞遷移實驗中，隨時間的延長每組細胞遷移的距離逐漸增大，即具有時效性，并且同一時間段的MDA-MB-231細胞遷移的距離，以轉(zhuǎn)染加藥組遷移距離最短，相對遷移率最低（ P<0.05）；在細胞凋亡實驗中，48h的凋亡率以轉(zhuǎn)染加藥組細胞最高，為34.78%±1.82，其次為空載加藥組（26.3%±

7、1.28）和轉(zhuǎn)染不加藥組（24.24%±1.14），最低為陰性對照組（7.99%±1.07）。
　　結(jié)論：
　　1.包裹ZIC1基因的慢病毒載體pLV-Zic1-PGK-puro穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的乳腺癌MDA-MB-231細胞中ZIC1的表達較慢病毒空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞中的表達明顯增強。
　　2.苦參堿作用轉(zhuǎn)染細胞或空載細胞48小時的50%抑制濃度（IC50）約為200mg/L。
　　3. ZIC1基因表達上調(diào)或苦參堿單獨作用