骨髓間充質干細胞(BMSC)旁分泌角化細胞生長因子(KGF)對脂多糖(LPS)誘導的小鼠肺泡上皮細胞(MLE12)損傷的修復作用及機制.pdf

1、背景：急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是指是由感染、機械刺激、休克、輸血等病因導致的肺毛細血管內皮和肺泡上皮彌漫性損害，以急性頑固性低氧血癥為臨床表現的急性呼吸衰竭,目前尚無有效治療手段改善ARDS的病死率。動物及細胞研究顯示，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)通過歸巢、移植再生作用、免疫調節(jié)、調節(jié)肺泡液

2、清除率、改變肺血管內皮通透性及其他機制促進肺損傷修復，為ARDS早期治療提供新思路。前期研究發(fā)現，MSC能明顯修復LPS誘導的ARDS小鼠肺上皮損傷，同時伴有肺泡灌洗液中KGF水平明顯增加，而KGF能影響肺上皮細胞的生長、分化和成型，因此可以推斷MSC可能通過旁分泌KGF修復ARDS肺上皮損傷，近年來許多研究發(fā)現了RAGE對于肺上皮的重要修復作用，因此上皮細胞的RAGE可能是KGF發(fā)揮作用的關鍵分子。
　　目的：本研究擬在體外BM

3、SC與肺泡上皮細胞間接共培養(yǎng)模型的基礎上，通過干預MSC的RAGE表達，探討ARDS時BMSC旁分泌KGF對肺泡上皮修復作用，以及上皮細胞的RAGE在BMSC旁分泌KGF對LPS誘導的肺泡上皮損傷修復中起到的作用，從而更好的理解MSC治療ARDS的機制，為今后改善MSC對ARDS的治療效果提供新的研究基礎。
　　方法：
　　1.建立LPS誘導的MLE12細胞損傷模型、體外間接共培養(yǎng)實驗模型及細胞處理
　　細胞分組如下：

4、空白組：MLE12單獨培養(yǎng)；損傷肺泡上皮細胞組：MLE12加入LPS孵育；間接共培養(yǎng)對照組：MLE12與MSC間接共培養(yǎng)；間接共培養(yǎng)損傷組：MLE12與MSC間接共培養(yǎng)加入LPS孵育；KGF組：MLE12加入LPS孵育，加入KGF；RAGE抗體組：MLE12與MSC共培養(yǎng)加入LPS加RAGE抗體。
　　2.標本的采集和檢測：間接共培養(yǎng)1d，3d或7d后，收集MLE12細胞，應用western blot方法測定細胞中RAGE，ZO-

5、1的含量；收集三個時間點的培養(yǎng)基，應用ELISA方法測定培養(yǎng)基上清液中KGF，RAGE的含量。
　　3.統計學方法：用SPSS統計學軟件進行統計分析，變量以均數+標準差(mean+SD)表示，多組計量資料間比較采用Bonferroni校正檢驗分析，以P<0.05提示差異有統計學意義。
　　結果：
　　1.MSC對肺上皮損傷有修復作用。在1d、3d、7d的3個時間點，各組MLE12表面的ZO-1表達，WB結果顯示損傷組較

6、空白對照組相比ZO-1蛋白表達量下降（P<0.05）；間接共培養(yǎng)損傷組較間接損傷組相比ZO-1蛋白表達量增加（P<0.05），KGF組較損傷組相比ZO-1蛋白表達量明顯增加（P<0.05）；
　　2.MSC修復上皮損傷，可能通過旁分泌KGF。在1d、3d、7d的3個時間點，各組條件培養(yǎng)基KGF表達，ELISA結果顯示損傷組較空白對照組相比，培養(yǎng)基上清液中KGF因子表達量下降（P<0.05）；間接共培養(yǎng)損傷組較損傷組相比，培養(yǎng)基上清

7、液中KGF因子表達量增加（P<0.05）。
　　3.MSC旁分泌KGF修復上皮損傷可能與調節(jié)上皮細胞的RAGE表達有關。在1d，3d的時間點各組上皮細胞 RAGE表達，WB結果顯示間接共培養(yǎng)損傷組較損傷組相比，RAGE蛋白表達量有所上升（P<0.05）；損傷組基礎上加入KGF的KGF組較損傷組相比，RAGE蛋白表達量明顯增加（P<0.05）。
　　在1d、3d、7d的3個時間點，各組條件培養(yǎng)基中RAGE的表達，ELISA結果

8、顯示損傷組較空白組相比，培養(yǎng)基上清液中RAGE因子表達量下降（P<0.05）；間接共培養(yǎng)損傷組較間損傷組相比，培養(yǎng)基上清液中RAGE因子表達量上升（P<0.05）；損傷組基礎上加入KGF的KGF組較損傷組相比，培養(yǎng)基上清液中RAGE因子表達量明顯上調。
　　結論:
　　1.BMSC對LPS誘導MLE12細胞損傷有修復作用。
　　2.BMSC旁分泌產生KGF因子在修復LPS誘導的MLE-12細胞損傷有重要作用，是肺泡上皮