Gutless腺病毒攜帶多順反子全長全長抗體基因細胞內(nèi)的表達研究.pdf

1、抗體藥物已經(jīng)成為生物制藥行業(yè)最熱門的領域，它能夠特異性的與疾病相關抗原結合，通過抗體的封閉作用或招募體內(nèi)的免疫分子實現(xiàn)靶向性治療的目的。純化的抗體蛋白用于治療仍然難以普及，因為抗體藥物相當昂貴，用基因治療的方法攜帶抗體基因在患者體內(nèi)表達功能性的全長抗體具有光明的前景。使用基因載體表達抗體，用于研究，可以降低抗體開發(fā)的成本，避免蛋白純化的復雜過程，縮短研發(fā)周期；用于治療，可以利用生物體自身機制，在體內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生活性治療抗體，獲得持續(xù)的治療效

2、果，避免蛋白的重復注射的花費及副作用?？贵w由輕重鏈形成4亞基復合體的復雜結構，決定了抗體基因治療比一般的小分子的基因治療更復雜，它需要在同一個細胞中同時表達抗體的輕鏈和重鏈。我們使用不同的多順反子結構表達抗體的重鏈和輕鏈，理論上攜帶抗體多順反子基因的單個gutless腺病毒顆粒感染細胞，就能夠在細胞中同時表達抗體的重鏈和輕鏈，然后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中裝配而成熟分泌到細胞外。為了深入的比較研究不同的順反子結構表達抗體的特點，以及輕重鏈基因順序?qū)ψ罱K

3、表達量的影響，我們設計了五種結構，分別為HIL、HAL、LAH、HFL，和LFH，然后將它們分別裝入gutless腺病毒載體中。此外，使用的是肝特異性TTR啟動子，將抗體基因表達限制在肝臟區(qū)域，減少蛋白全身表達的毒性。 我們成功地擴增出五種攜帶抗體多順反子基因的gutless腺病毒。感染多種肝細胞系，用抗原包被ELISA檢測培養(yǎng)液中抗體表達，發(fā)現(xiàn)HIL，HFL在所有細胞系中都有明顯的抗體表達，而HAL、LAH只在HepG2和H

4、ep3B細胞系中有相對很高的抗體表達。HAL和LAH表達細胞系差異明顯，可能是由于2A序列在這些細胞中剪切活性的差別造成的。此外，LAH結構表達量比HAL高，可能是由于2A體外不平衡剪切引起LAH結構輕鏈冗余，促進了抗體的裝配與分泌。使用兩種抗體定量的方法，我們測得LAH結構以5000vp/cell感染HepG2細胞后的細胞培養(yǎng)液中抗體的表達量，約300ng/mL。然后，Westernblot分析，檢測到非還原性條件下抗體150KD條帶

5、，也檢測到還原性條件下的輕鏈結構。我們還在購買抗體，改進抗體定量和Westernblot檢測方法，期望獲得更準確的結果。 我們的試驗證明了gutless腺病毒載體用于抗體基因治療具有低細胞毒性和允許高感染復數(shù)的特點，這些都有利于高效的抗體表達;提高病毒感染復數(shù)，即提高外源基因在細胞內(nèi)的拷貝數(shù)，能夠提高抗體的表達量。精細的結構比較中，不同的多順反子結構在不同細胞系中表達差異明顯，在BEL7404細胞系中，HFL和HIL抗體表達量