基于稀土納米管構建高效的上轉(zhuǎn)換熒光生物成像劑.pdf

1、目的：光學生物成像技術是一種簡單、高效、靈敏且成本低廉的分子成像技術，能夠很好的反應光與組織之間的相互作用，是一種常見的臨床診療手段。但是光學生物成像在臨床上的應用，很大的程度上受限于傳統(tǒng)熒光成像劑的激發(fā)波長在可見光范圍(700nm)以內(nèi)，從而導致其組織穿透能力極其有限（約幾毫米）。而眼部由于特殊的生理結構，光學生物成像技術在眼科的應用更是面臨巨大的挑戰(zhàn)。在本論文中，我們構建了以稀土納米管為基礎的新型上轉(zhuǎn)換納米熒光成像劑，可以實現(xiàn)在近紅

2、外(700-1000 nm)范圍內(nèi)激發(fā)，并在可見光范圍內(nèi)發(fā)射熒光、采集信號，從而有望將傳統(tǒng)光學成像的組織穿透能力提高到厘米級別，有效提高成像分辨率、減少背景干擾，并有望進一步實現(xiàn)眼部光學生物成像。我們選用了高熒光強度的鐿(Yb)，鉺(Er)摻雜的硫氧化釓(Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+)，并將其制備成納米管，以便其能更容易的進入細胞與組織，并有效保持熒光性能;同時通過制備條件優(yōu)化，控制產(chǎn)物的形貌、尺寸、熒光強度和顏色，為所制備的納米

3、管在生物光學成像上的應用提供物質(zhì)基礎。為了探討所制各的納米管熒光成像劑在生物成像上的應用，本論文還進一步對所得產(chǎn)物的生物相容性，及其在眼部細胞（如視網(wǎng)膜色素上皮細胞）和動物體內(nèi)的成像效果進行了初步研究，揭示了所構建的納米管熒光成像劑在生物成像與臨床診療上的巨大應用前景。
　　方法：⑴Gd(OH)3納米管的制備:將2 mmol的Gd(NO3)3加入到25 mL去離子水中形成澄清溶液，在攪拌條件下，用質(zhì)量分數(shù)為25％的氨水調(diào)節(jié)溶液pH

4、至10。繼續(xù)攪拌10 min，然后將體系加熱到75℃，反應18h。將反應得到的白色沉淀收集、離心分離，分別用去離子水和乙醇洗滌若干次，在60℃烘箱中干燥24 h。摻雜Er3+，Yb3+的Gd(OH)3納米管的合成與純的Gd(OH)3納米管的合成相似，僅在第一步中用相應比例的Er(NO3)3，Yb(NO3)3溶液代替Gd(NO3)3溶液。Gd2O2S∶Er3+/Yb3+納米管的合成:將所得的Gd(OH)3∶ Er3+/Yb3+納米管在氮氣

5、和硫磺的氣氛中于一定溫度下煅燒2小時。⑵Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+納米管的細胞毒性檢測（CCK-8）:將ARPE-19細胞（一種典型的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞株）在96孔板中培養(yǎng)24 h使細胞黏附。實驗組細胞中分別加入不同濃度的Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+納米管(25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL和200μg/mL)，以正常培養(yǎng)的細胞為對照組。每個濃度有6個平行孔，定時培養(yǎng)24 h，48 h和72 h。隨后通過C

6、CK-8試劑盒檢測Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+對ARPE-19細胞存活率的影響，分析納米材料的生物相容性。細胞透射電鏡觀察:以人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19)為研究對象，分為實驗組和對照組，實驗組用100μg/mL的Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+納米管對細胞分別處理不同的時間段(2h，6h，24 h)后，觀察納米材料對細胞內(nèi)部結構的影響。⑶將ARPE-19細胞接種于24孔板中，孵育24 h。每孔中加入50μg/mL的Gd

7、2O2S∶Er3+/Yb3+納米管培養(yǎng)6h后，利用Hoechst33258染液對細胞核進行染色，置于倒置熒光顯微鏡下觀察材料是否進入細胞及能否觀察到熒光。⑷Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+納米管在裸鼠體內(nèi)的成像將3％，1mL/Kg的戊巴比妥鈉和0.2mL/Kg的鹽酸甲苯噻嗪皮下注射入裸鼠體內(nèi)以麻醉裸鼠。用10 mg/mL的Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+納米管的水溶液皮下注射入裸鼠體內(nèi)，最后將麻醉的裸鼠置于小動物活體成像儀的托盤上，

8、在980 nm激光照射下進行體內(nèi)熒光成像的測試。
　　結果：成功合成了具有上轉(zhuǎn)換熒光性能的Gd2O2S∶ Er3+/Yb3+納米管，通過條件優(yōu)化，實現(xiàn)對納米材料的形貌、熒光強度和熒光性能等的可控合成。所合成的熒光納米管表現(xiàn)了良好的生物相容性，并在低濃度的時候?qū)毎纳L具有一定的促進作用。透射電鏡結果證實了所合成的納米管能夠穿透細胞膜，進入到細胞內(nèi)部。體外細胞成像結果進一步證實了所制備的納米管能夠進入到細胞內(nèi)部，并在近紅外激光(9

9、80 nm)激發(fā)下產(chǎn)生明顯、清晰、低背景的熒光信號，能夠很好的實現(xiàn)高效的細胞內(nèi)成像。小動物活體成像結果顯示所制備的納米管在動物體內(nèi)，在近紅外激光的激發(fā)下，能夠檢測到清晰的熒光信號，并且無背景熒光的干擾，表明其在動物體內(nèi)光學成像和臨床疾病診療上的巨大應用潛能。
　　結論：通過合成具有上轉(zhuǎn)換熒光性能的稀土納米管，實現(xiàn)了在近紅外光的激發(fā)下，產(chǎn)生可見光范圍的熒光，有效提高了光學生物成像的組織穿透能力與抗背景干擾能力。納米管的特殊形貌，使得

10、納米材料能夠有效的進入細胞與組織內(nèi)部，從而實現(xiàn)細胞及體內(nèi)的高效生物成像。生物相容性實驗結果表明所制備的納米管材料對眼部細胞具有很好的生物相容性，并且在一定的濃度范圍會對細胞的生長起到促進作用，表明其在眼內(nèi)乃至體內(nèi)生物成像的應用可行性。體外細胞熒光成像和體內(nèi)活體熒光成像結果表明了所制備的納米管熒光成像劑能夠在近紅外光源激發(fā)下，高效實現(xiàn)可見光范圍內(nèi)成像，有效的推動了光學成像技術在臨床（尤其眼科）疾病診斷和治療等方面的應用，具有很好的研究與應