非洲馬瘟病毒VP7蛋白的原核表達及其間接ELISA方法的建立.pdf

1、本研究用原核系統(tǒng)成功表達了非洲馬瘟病毒（African horse sickness virus，AHSV）群特異性蛋白AHSV-VP7，并建立了一種可快速檢測非洲馬瘟病毒9個血清型的間接ELISA方法，該方法特異、靈敏，與國外標準ELISA試劑盒符合率達到100％。
　　 本試驗針對非洲馬瘟病毒的群特異性蛋白VP7，通過在GenBank對VP7蛋白基因進行比對，選取最保守基因序列進行密碼子優(yōu)化以增加其表達量，設計并合成一對引物

2、對目的基因進行PCR擴增，將擴增的目的基因連接到pMD18-T載體中，利用EcoRⅠ和HindⅢ進行雙酶切，與原核表達載體pET-30a(+)共同構建pET-30a-VP7重組質粒，轉化入宿主菌大腸桿菌Rosetta(DE3)中高效表達，得到分子量為44ku的目的蛋白。對其進行SDS-PAGE和Western-blot分析，結果顯示目的蛋白獲得高效表達且有特異的免疫學活性。通過對誘導條件進行優(yōu)化，使目的蛋白表達量增多。然后利用His·B

3、ind kits對目的蛋白進行純化，得到具有抗原活性的純化蛋白，以此作為檢測抗原，建立了檢測非洲馬瘟病毒抗體的間接ELISA方法。通過對該間接ELISA方法的抗原包被量、血清稀釋倍數(shù)、封閉液的選擇等反應條件進行了優(yōu)化。確定抗原最佳包被濃度為0.625 ng/μL，一抗最佳工作濃度為1∶50，作用時間為30min，二抗最佳工作濃度為1∶40000，作用時間為45min，臨界值為0.36,用建立方法檢測133份血清樣品，并與國外試劑盒進行結