Ppm1a在血管穩(wěn)態(tài)維持中的功能研究.pdf

1、第一部分:Ppm1a在血管穩(wěn)態(tài)維持中的功能研究
　　血管穩(wěn)態(tài)維持是機體生命活動的基礎。血管為機體組織供應氧和營養(yǎng)物質，以及將其產(chǎn)生的代謝廢物排出體外。目前，血管疾病已成為危害人類健康的重要殺手，如何提高血管疾病的診斷及預防已成為當今人類急切需要解決的社會及科學問題。而這些疾病的病理基礎都是血管結構及血管功能的異常。因此，闡明生理狀態(tài)下血管結構、血管功能的調控機制以及血管疾病的發(fā)病機制將為血管疾病以及以血管病變?yōu)榛A的其他諸多疾病的

2、預防與診斷提供理論基礎。盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多重要的相關基因及相關的分子機制參與血管疾病的調控。但還有待更深入的研究，因此發(fā)現(xiàn)血管疾病的調控基因，為血管疾病的診斷和治療提供新靶標，將有很重要的意義。
　　鎂離子依賴的蛋白磷酸酶1A（Protein phosphatase,magnesium-dependent1A，PPM1A）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PPM家族的成員,具有鎂離子或錳離子依賴性的單體磷酸酶。Ppm1a的底物廣泛，能與

3、眾多蛋白結合使其去磷酸化，從而發(fā)揮作用。轉化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路參與對血管發(fā)育及血管穩(wěn)態(tài)維持的調控，并在其中發(fā)揮著重要功能。許多TGF-β信號通路成員，無論是配體Tgfβ1，受體Tgfβr2、Alk1、Alk5等，還是胞內信號介導者Smads，其敲除小鼠都表現(xiàn)出嚴重血管發(fā)育缺陷。雖然遺傳修飾小鼠的研究指出TGF-β信號通路的阻斷會導致小鼠在胚胎期血管出現(xiàn)嚴重缺陷。然

4、而TGF-β信號水平被過度激活后，其在血管中的功能研究以及相關的小鼠模型仍然有所欠缺。根據(jù)以往的文獻報道可知，Ppm1a是TGF-β信號通路的負調控因子， Ppm1a作為蛋白磷酸酶能使P38去磷酸化抑制TGF-β信號，也能通過去磷酸化Smad2/3抑制TGF-β信號。此外，Ppm1a降低Smad蛋白水平抑制骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）信號。那么，在內皮細胞中特異性敲除Ppm1a是否能過度激活

5、TGF-β信號Ppm1a在血管內皮細胞中是否具有功能？本項研究通過對內皮細胞特異性敲除的Ppm1a小鼠的表型分析，探索Ppm1a在血管穩(wěn)態(tài)維持中的生理功能以及其分子機制。
　　利用實驗室構建的內皮細胞特異性的Tie-Cre轉基因小鼠與Ppm1a條件基因打靶小鼠交配，獲得內皮細胞特異性敲除的Ppm1a小鼠。接下來，我們對內皮Ppm1a突變小鼠進行表型分析。通過對突變小鼠的觀察，發(fā)現(xiàn)其能正常出生并存活。并對突變小鼠胚胎期的血管結構進行

6、分析，發(fā)現(xiàn)并無明顯異常。接著，我們對兩月齡的突變小鼠的腦、主動脈、腎、肺等進行組織切片觀察，結果顯示與對照小鼠相比，成年條件敲除小鼠的血管結構也沒有發(fā)生明顯異常。
　　內皮細胞膜結合粘蛋白Endomucin是一種糖蛋白，被認為是內皮細胞的標志物。以往的研究表明，Endomucin主要表達在小鼠胚胎血管內皮細胞、成體的靜脈及微血管內皮細胞中，在成體主動脈的內皮細胞中并不表達。Endomucin具有一些生理功能，如在正常狀態(tài)下，End

7、omucin能抑制中性粒細胞與內皮細胞的粘附，從而維持血管的穩(wěn)態(tài)。而在炎癥狀態(tài)下，Endomucin的低表達能促進中性粒細胞與內皮細胞的粘附。通過對成體小鼠的腦、主動脈、腎、肝、心臟、肺等進行Endomucin免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)內皮Ppm1a突變小鼠的主動脈內皮Endomucin表達顯著增強。我們進一步對不同時間段的突變小鼠進行主動脈內膜Endomucin檢測，發(fā)現(xiàn)出生后七天的條件基因敲除小鼠主動脈Endomucin同對照小鼠一樣不表達

8、。而出生一個月以后的突變小鼠，其主動脈內膜Endomucin持續(xù)表達。說明內皮Ppm1a突變小鼠的主動脈內皮細胞Endomucin是獲得性表達。進一步我們利用免疫組化實驗，對TGF-β信號通路中一些重要分子的活化水平進行檢測。我們發(fā)現(xiàn)與對照小鼠相比，條件基因敲除小鼠主動脈內膜磷酸化Smad1/5/8的表達上調。上述結果提供體內證據(jù)表明Ppm1a可以負調控內皮細胞Smad1/5/8的活化。Smad1/5/8活化與Endomucin獲得性表

9、達具有怎樣的相關性，以及Endomucin的獲得性表達具有怎樣的生理意義尚有待進一步研究。
　　根據(jù)已有的文獻報道可知，TGF-β信號異常激活促進內皮細胞間充質轉化。我們進一步檢測了內皮 Ppm1a敲除小鼠的腎、肺、主動脈、腦等組織是否發(fā)生了內皮細胞間充質轉化。通過Masson染色實驗，與對照小鼠相比，內皮Ppm1a突變小鼠并沒發(fā)生明顯的纖維化，提示內皮Ppm1a突變小鼠無明顯的內皮細胞間充質轉化發(fā)生。此外，我們對敲除小鼠進行低氧

10、低壓應激誘導處理，與上述結果一致，經(jīng)低氧低壓處理的突變小鼠也無內皮細胞間充質轉化發(fā)生。
　　血腦屏障作為腦血管特化屏障結構，能夠精確控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周血中各種物質的進出，從而保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的高度穩(wěn)定，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學意義。TGF-β信號通路在血腦屏障的成熟過程中發(fā)揮著重要作用。我們檢測了正常情況下內皮細胞Ppm1a突變小鼠血腦屏障是否發(fā)生滲漏，與對照小鼠相比，突變小鼠在正常下并無血腦屏障的

11、滲漏。而根據(jù)以往的文獻報道可知，缺氧是眾多腦血管疾病的根源，其主要是影響腦組織的血腦屏障。因此，我們也檢測了在低氧低壓應激誘導處理后的內皮Ppm1a敲除小鼠血腦屏障的滲漏情況，發(fā)現(xiàn)低氧低壓應激誘導處理后內皮Ppm1a突變小鼠的血腦屏障完整性與對照小鼠相比并無明顯異常。綜上所述，小鼠血管內皮細胞中敲除Ppm1a，對成體重要器官包括腦、腎、肝、心臟等的血管結構無顯著影響。但能使主動脈中內皮細胞Endomucin獲得性表達，主動脈內皮細胞磷酸

12、化Smad1/5/8表達上調。本研究首次系統(tǒng)闡述內皮細胞Ppm1a在血管發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持中的生理功能，為血管發(fā)育與穩(wěn)態(tài)維持機制的新認識提供遺傳學依據(jù)。
　　第二部分:腦血管內皮細胞中TGF-β以Smad4依賴的方式上調Notch4
　　轉化生長因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路與Notch信號通路在血管發(fā)育以及血管疾病的發(fā)生過程中起重要作用。在內皮細胞中，TGF-β信號通路與

13、Notch信號通路的相互作用已被報道。此外，以往的研究發(fā)現(xiàn)在腦血管內皮細胞中通過TGF-β/Smad4與Notch信號通路的協(xié)同作用來維持血管的完整。之前，我們發(fā)現(xiàn)在Smad4缺損的內皮細胞中，Notch信號明顯下調。然而，Notch受體是否作為TGF-β/Smad4信號通路下游靶分子而被TGF-β/Smad4直接調節(jié)，至今未見報道。在本項研究中，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1和骨形成蛋白4（Bone morphogenetic protein4