幾種鲆鰈魚(yú)類(lèi)Myostatin基因的克隆及結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析.pdf

1、Myostatin(MSTN，肌肉生長(zhǎng)因子)，又名GDF8，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B(TGFβ)家族成員。哺乳類(lèi)中在主要在發(fā)育的和成年個(gè)體的骨骼肌中表達(dá)，起著抑制肌肉生長(zhǎng)的作用。Myostatin缺失突變純合小鼠單塊肌肉的重量約為野生小鼠的2～3倍；具有增加的骨骼肌質(zhì)量的牛品系——“雙肌牛”，如比利時(shí)藍(lán)牛和皮德蒙特?！词沁@一基因自然突變的結(jié)果。正是由于MSTN基因?qū)∪馍L(zhǎng)的控制，使其在水產(chǎn)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值?；谶@一原因，我們從幾種

2、重要的鰈形目養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)入手，分離并克隆了這些魚(yú)的MSTN基因，并對(duì)其進(jìn)行了序列分析和表達(dá)研究，同時(shí)我們還對(duì)牙鲆胚胎發(fā)育過(guò)程中內(nèi)參基因的表達(dá)變化進(jìn)行了研究，篩選出了適合魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)研究的合適內(nèi)參。得到以下結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)采用同源克隆和錨定PCR的方法，從牙鲆(Paralichthys olivaceus)肌肉中獲得了長(zhǎng)為5538 bp的牙鲆MSTN基因組序列。該序列包含3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子。其中內(nèi)含子1長(zhǎng)362bp，內(nèi)含

3、子2長(zhǎng)762bp，拼接后的外顯子總共長(zhǎng)1134bp，編碼378個(gè)氨基酸，其中含有9個(gè)保守的半胱氨基酸殘基和一個(gè)保守的蛋白酶加工位點(diǎn)RVRR。在MSTN基因的5’上游序列中包含有一個(gè)潛在的TATA盒和12個(gè)E-box位點(diǎn)。同時(shí)序列分析表明牙鲆MaN的5’-UTR、內(nèi)含子2和3’UTR都存在微衛(wèi)星序列。RT—PCR結(jié)果顯示，MSTN在肌肉、眼、腦、卵巢、腎臟、鰓弓軟骨、心臟、肝臟、脾臟、鰓絲、腸、精巢和血液中都有表達(dá)，但表達(dá)量明顯不同。我們

4、還發(fā)現(xiàn)MSTN在腦中的表達(dá)也存在著明顯的差異。定量PCR分析暗示牙鲆MSTN的表達(dá)受發(fā)育的調(diào)節(jié)，不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量的變化明顯不同。并且在未受精的卵細(xì)胞中也檢測(cè)到了牙鲆MSTN的mRNA，暗示這可能是母體mRNA的存留。 為篩選出了適合魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)研究的合適內(nèi)參，我們對(duì)牙鲆胚胎發(fā)育過(guò)程中看家基因的表達(dá)變化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明多數(shù)常用的mRNA基因并不適合用于整個(gè)胚胎期間基因表達(dá)的校正，它們?cè)谂咛グl(fā)育的過(guò)程中表達(dá)變化明

5、顯。盡管如此，某些基因在牙鲆胚胎發(fā)育過(guò)程中依舊存在階段性穩(wěn)定表達(dá)。在整個(gè)胚胎發(fā)育階段表達(dá)最穩(wěn)定的是18S rRNA基因，因而可以將其用作整個(gè)胚胎期間基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因。 對(duì)牙鲆30個(gè)個(gè)體的開(kāi)放閱讀框60個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行了測(cè)序，鑒定了19個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNPs)。其中11個(gè)導(dǎo)致了氨基酸序列的變化，8個(gè)為中性突變，并不改變氨基酸的序列。根據(jù)內(nèi)含子2和3'-UTR中的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物對(duì)存在于養(yǎng)殖群體中的生長(zhǎng)速率不同的兩類(lèi)個(gè)體

6、進(jìn)行的檢測(cè)并未擴(kuò)增出大小個(gè)體所特有的條帶，暗示著這兩個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)很可能與生長(zhǎng)速率并無(wú)直接的關(guān)系。 對(duì)牙鲆腹腔注射滅活鰻弧菌，觀測(cè)MSTN在肌肉、肝臟、腎臟中的表達(dá)。結(jié)果顯示，滅活鰻弧菌的刺激并未對(duì)三種組織中MSTN的表達(dá)量造成顯著性的改變(P>0.1)。然而在整個(gè)刺激期間，肝臟和腎臟中卻觀察到了比注射生理鹽水的對(duì)照略高的表達(dá)，盡管在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。推測(cè)可能高劑量的滅菌鰻弧菌對(duì)肝臟和腎臟造成了輕微的損傷，使MSTN的表達(dá)量略微升高

7、，就如同在哺乳動(dòng)物心肌梗死的病灶區(qū)域觀測(cè)到MSTN升高的表達(dá)一樣。 采用同源克隆的方法，從半滑舌鰨、大菱鲆、石鰈的肌肉中獲得了三種魚(yú)的全長(zhǎng)MSTN eDNA序列。舌鰨MSTN eDNA序列全長(zhǎng)1584bp，包括49 bp的5'UTR,3'UTR長(zhǎng)401 bp以及1134 bp的ORF，編碼377個(gè)氨基酸。大菱鲆MSTN cDNA序列全長(zhǎng)2559bp，包括48 bp的5'UTR，3'UTR長(zhǎng)1380 bp以及1131 bp的ORF

8、，編碼376個(gè)氨基酸。石鰈MSTN cDNA序列全長(zhǎng)2457bp，包括50 bp的5'UTR，3'UTR長(zhǎng)1273 bp以及1134 bp的ORF，編碼377個(gè)氨基酸。所有三種魚(yú)的MSTN cDNA的3'UTR區(qū)都含有脊椎動(dòng)物典型的加尾信號(hào)AATAAA。使用基因特意性引物擴(kuò)增三種魚(yú)的基因組DNA，分別得到了三種魚(yú)的內(nèi)含子序列，石鰈MSTN的兩個(gè)內(nèi)含子intronⅠ、intronⅡ，大小分別為348 bp、703 bp，大菱鲆MSTN的兩

9、個(gè)內(nèi)含子大小分別為254 bp、845 bp，半滑舌鰨MSTN的兩個(gè)內(nèi)含子分別為740 bp、403 bp。盡管MSTN的內(nèi)含子在這三種魚(yú)中有較大的差別但都顯示了保守的內(nèi)含子一外顯子邊界，符合GT-AG規(guī)則。分析這些MSTN的內(nèi)含子和3'非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)，這些區(qū)域存有微衛(wèi)星重復(fù)。組織分布研究揭示了半滑舌鰨MSTN表達(dá)的廣譜性，差異性。盡管MSTN在肌肉、腦、卵巢、腎臟、心臟、肝臟、脾臟、鰓絲、腸和精巢中都有表達(dá)，但只有肌肉高量表達(dá)MSTN基