腫瘤相關基因t351的初步研究.pdf

1、在腫瘤免疫治療中，抗體靶向治療因其特異性強、靶向性高和治療過程相對較短而備受重視?？贵w靶向治療包括：抗腫瘤單克隆抗體直接體內應用；抗腫瘤單克隆抗體與抗腫瘤藥物、生物毒素或同位素偶聯，通過抗腫瘤單抗將效應分子引導至腫瘤局部，殺傷腫瘤等。目前，在國外已有8種治療型抗體藥物被批準正式進入臨床，用于腫瘤治療。同時，將抗體偶聯上放射性核素用于腫瘤診斷也已經在臨床得到越來越廣泛的應用。本課題的目的即通過對腫瘤相關基因T351特異性抗體的治療腫瘤作用

2、的研究，為治療型抗體的應用奠定基礎。 在研制腫瘤治療和診斷型抗體時，有效的腫瘤抗原和相應的高特異性抗體是兩個關鍵因素。在前期工作中利用差異顯示發(fā)現了一個肺癌高表達新基因t351，為了將其開發(fā)成具有腫瘤診斷或(和)腫瘤治療價值的單克隆抗體，本文做了以下研究： 一、利用生物信息學方法，對t351基因編碼蛋白的結構，功能和細胞定位進行了分析和預測。分析結果表明，該基因編碼蛋白是與物質運輸有關的膜定位蛋白，具有6個跨膜區(qū)。利用R

3、T-PCR及實時定量PCR方法，在mRNA水平對t351基因在多發(fā)腫瘤及瘤旁組織和多種腫瘤細胞系中的表達情況進行了研究。結果顯示，該基因在腫瘤組織和腫瘤細胞系中呈廣泛高表達，其腫瘤組織中的表達水平是相應癌旁組織的1.3～9.2倍。 二、根據對糖基化和磷酸化位點的預測結果，選取了編碼胞外區(qū)的一段基因序列進行表達。構建了所選t351基因片段的原核表達質粒pET25b(+)—351philic。經過轉化宿主菌大腸桿菌BL—21，IPT

4、G誘導表達，純化等一系列工作，獲得了該基因的編碼重組蛋白。經SDS-PAGE，Western等方法鑒定，得到的蛋白純度較高，可以用來作為抗原制備相應的單克隆抗體。 三、用制備的蛋白免疫BALB/C小鼠，通過經典雜交瘤技術，制備出了針對t351蛋白親水片斷的單克隆抗體。經過對得到單抗的一系列鑒定，篩選出三株雜交瘤細胞，C1—1，C1—8和C6—5。這三株雜交瘤細胞抗體效價高，可結合原核表達的t351蛋白親水片段以及高表達t351基

5、因的細胞膜蛋白。將雜交瘤小鼠腹腔注射獲得腹水，經純化得到了高純度的單克隆抗體。 四、以得到的單抗為工具，經免疫組化，流式細胞分析，從蛋白水平分析了t351基因在腫瘤組織和腫瘤細胞系細胞的表達，以及其在組織和細胞中的定位情況。結果顯示，該基因編碼蛋白在腫瘤組織和細胞都有較高的表達。免疫組化結果還觀察到該蛋白同時表達在胞漿和胞膜。 五、以BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞為效應細胞，腫瘤細胞HepG2，HT29和GLC—82為靶細

6、胞，t351蛋白單抗C1—1為中介，行ADCC實驗；研究該抗體作為治療型抗體的可行性。結果表明，C1—1介導了較高的殺傷效應，可進一步用于腫瘤免疫治療的研究。 六、用放射性核素99mTc標記單抗C1—1，做體外結合腫瘤細胞實驗和荷瘤小鼠體內顯影。二者結果均不理想。其可能原因是標記抗體條件不適合，使得標記后抗體對細胞的結合下降。 綜上所述，t351基因是一個在腫瘤中廣泛表達和高表達的基因，其編碼蛋白為膜蛋白，可以做為腫瘤免