新型乙型肝炎病毒細胞感染模型的建立.pdf

1、研究背景
　　 乙型肝炎病毒感染是全球范圍內影響人類健康的重大問題，我國是乙型肝炎高流行地區(qū)，全國一般人群HBsAg陽性率為9.09％，估計約1.2億人為慢性HBV感染，占全世界慢性HBV感染人數的1/3[1]。目前人們對HBV及其所致疾病有了相當深入的認識，但由于缺乏合適的動物模型及體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，乙型肝炎病毒的生物學研究和治療進展緩慢[2-6]?，F(xiàn)有用于研究HBV的細胞模型主要是人原代肝細胞和肝癌細胞系，前者保留了分化肝細

2、胞的重要細胞學特性，但其缺陷在于在體外培養(yǎng)幾天后開始出現(xiàn)肝細胞特殊形態(tài)的消失，并且失去了對HBV的感染和復制能力，因而限制了其應用；而后者是通過轉染HBV基因組或添加化學試劑而非HBV自然感染的方式進入到細胞中，因此不能用于HBV早期感染過程的研究。為此，本研究旨在通過將經化學誘變劑誘導產生次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)基因突變的HepG2細胞與未攜帶HBV的人原代肝細胞融合建立一新型細胞系，使其能夠自然感染HBV并能體外傳

3、代培養(yǎng)，為HBV感染宿主細胞的早期機制的研究，以及病毒侵入人肝細胞后完整的復制過程的研究提供一個強有力的工具。
　　 目的
　　 建立一新型細胞株，使該細胞株既能自然感染HBV又能傳代培養(yǎng)，評價雜交細胞對HBV的自然感染能力。
　　 方法：
　　 分離培養(yǎng)未攜帶HBV的人原代肝細胞，與誘導突變的HepG2細胞進行融合得雜交細胞，經HAT培養(yǎng)基篩選，利用胰蛋白酶G顯帶技術鑒定所得細胞，用含HBV的慢性乙型肝

4、炎患者血清感染雜交細胞（同時感染HepG2作為對照），巢式PCR檢測感染后細胞內HBVDNA合成及分泌情況及有無HBV復制中間產物HBVcccDNA，間接免疫熒光檢測感染后細胞內HBcAg的表達，電化學發(fā)光法檢測感染后細胞培養(yǎng)上清中的HBsAg和HBeAg。
　　 結果：
　　 成功建立人原代肝細胞與HepG2的雜交細胞，能體外傳代培養(yǎng)，染色體核型分析示雜交細胞染色體眾數為99條，證實為融合細胞，HBV感染后第4天起，雜

5、交細胞內和培養(yǎng)上清中均能檢測到HBVDNA，HBV感染后第3天起，雜交細胞內可以檢測到HBV的復制中間產物HBVcccDNA，HBV感染后第4天起，雜交細胞胞漿及部分胞核內HBcAg始終是陽性表達，間接免疫熒光染色呈胞漿彌漫性著色，電化學發(fā)光法檢測培養(yǎng)上清中HBsAg及HBeAg持續(xù)表達；而感染后的HepG2細胞檢測結果均為陰性。
　　 結論：
　　 成功建立了一個兼具有人原代肝細胞和HepG2細胞遺傳特性的雜交細胞株，