人HRP-2分子的二聚體生物學特性和sumo化修飾篩選基因.pdf

1、肝癌衍生生長因子HDGF(Hepatoma-derivedgrowthfactor)最初是從無血清培養(yǎng)人類肝癌細胞株HUH-7中純化得到的高肝素親和性生長因子，具有促成纖維細胞，內(nèi)皮細胞，血管平滑肌細胞和一些肝癌細胞等多種細胞生長的功能。其家族成員包括HDGF和其相關蛋白HRPs以及LEDGF，其共同的結構特征是N端有一高度保守的HATH區(qū)，N端無類似信號肽的疏水區(qū)，具有二分的NLS。 ffRP-2基因是最新發(fā)現(xiàn)的HDGF相關蛋

2、白家族的一個重要成員，定位于19p13．3區(qū)帶，由12個外顯子組成，其cDNA全長2344bp，編碼671個氨基酸。HRP-2與HDGF的同源性為12．7％。其N端也有一個高度保守的HATH(PWWP)結構域。 HDGF家族的HATH區(qū)同源性很高，高同源性提示HATH是維持HDGF家族分子功能的重要功能域。HATH區(qū)也有類似的核定位信號。業(yè)已證實，轉錄協(xié)同因子P52／P75中N端也有和HDGF的HATH同源度達71％的區(qū)域。P5

3、2／P75通過介導上游特異序列激活子和轉錄復合物結合從而影響轉錄。因此推測HATH區(qū)也有部分定位到細胞核的作用。此外，HATH區(qū)可能與肝素的結合有關?，F(xiàn)有研究表明，突變或缺失HATH區(qū)的外源性HDGF蛋白不能進入細胞。這提示HATH區(qū)可能在HDGF家族靶向到細胞中發(fā)揮重要作用。Hepatoma—derivedgrowthfactorrelatedproteinII(HRP-2)是HDGFs家族一個重要成員，其N端也有一個HATH結構域。

4、 本研究通過體外表達HATH(PWWP)融合蛋白，再過分子篩時發(fā)現(xiàn)有雙峰的特性，經(jīng)分析顯示分子量約為單體和二聚體，由此提示該分子有單體和二聚體兩種形式。繼而非變性膠實驗也證實這一點。為排除融合蛋白GST本身形成二聚體，采用全長hrp-2／myc和hrp-2A／myc(HATH)，B／myc(中斷)，C／myc片斷(尾巴)與GST-HATH(PWWP)作PULL-DOWN分析，實驗結果證明人HRP-2的HATH(PWWP)結構域能

5、形成二聚。正如P53等很多蛋白必須形成多聚體結構才有活性，HRP-2可能通過HATH結構域形成二聚體產(chǎn)生相應的生物學活性，但確切機制及相應功能還有待進一步的研究。 此外我們還建立了體內(nèi)小泛素化樣修飾(SUMO)系統(tǒng)。細胞生命活動的調(diào)控在分子水平表現(xiàn)為蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)的相互作用協(xié)調(diào)性。此協(xié)調(diào)性可通過可逆性蛋白質(zhì)共價修飾來進行。SUMO(Smailubiquitin-1ikemodifier)是近年來發(fā)現(xiàn)的在結構上類似于泛素的一類小分

6、子蛋白質(zhì)修飾物，SUMO通過與靶蛋白共價結合修飾廣泛參與蛋白質(zhì)轉錄、核內(nèi)轉運與定位、信號轉導和維持基因組穩(wěn)定等功能。目前己發(fā)現(xiàn)有4種SUMO家族蛋白(SUMO-1，-2，-3andsumo-4)和至少50種SUMO修飾的底物被鑒定。SUMO的研究涉及到多種重要的功能包括：信號轉導，轉錄，蛋白質(zhì)轉運，DNA損傷修復和染色體分離。其中蛋白激酶的SUMO化修飾對其正確的細胞內(nèi)定位及功能是至關重要的。我們通過SUMOplot分析軟件對實驗室40