體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為角膜上皮細胞的初步研究.pdf

1、研究背景與目的 角膜上皮再生的來源是角膜緣干細胞，干細胞的缺失會導致嚴重的眼表異常，包括角膜新生血管、角膜結膜化、角膜潰瘍穿孔以及帶狀角膜病變等。 以自體或同種異體角膜緣移植，因供體來源不足及異體移植引起的排斥反應而受限；而單純羊膜移植重建眼表，因無上皮再生來源的干細胞而不能治療角膜緣嚴重受損的眼表傷。組織工程技術的發(fā)展為解決這一問題帶來了希望。 盡管大量研究用角膜緣干細胞作為種子細胞，但細胞來源的有限性使其應用

2、和推廣受到限制。 研究表明，成年人骨髓中存在著多潛能性的間充質干細胞(mesenchymalstem cell，MSC)，在體外不同條件下可以定向地被誘導分化為心肌細胞、脂肪細胞、上皮細胞、內皮細胞、神經細胞、骨、軟骨、肌腱及骨髓基質等不同細胞。這類細胞來源確切、充足，取材方便，分化潛能大，避免了胚胎干細胞可能面臨的倫理學問題，并且因為是自體組織，所以不存在排斥反應，可能具有更加良好的應用前景。 角膜基質是角膜上皮細胞和

3、角膜緣干細胞的微環(huán)境，具有維持角膜上皮細胞特性的作用。角膜基質含有多種自分泌和旁分泌細胞因子及其受體，共同組成了角膜緣基質層復雜的細胞因子調控微環(huán)境，維持角膜緣干細胞的正常分化、繁殖和不進入終極分化。 本實驗的目的是利用組織工程技術體外培養(yǎng)骨髓MSC，與角膜基質細胞共培養(yǎng)誘導骨髓MSC向角膜上皮細胞轉化，通過對骨髓MSC向角膜上皮細胞分化潛能的研究，探討骨髓間充質干細胞作為構建組織工程化角膜種子細胞的可行性及其重建角膜上皮的可能

4、性。 方法 （1）采用Percoll密度梯度離心培養(yǎng)技術結合貼壁培養(yǎng)法對大鼠骨髓間充質干細胞分離、純化和原代、傳代培養(yǎng)觀察，免疫細胞染色。 （2）對體外培養(yǎng)的大鼠骨髓MSC進行形態(tài)學觀察、免疫熒光染色檢測表面抗原標記，確認為培養(yǎng)的細胞為骨髓MSC。 （3）觀察大鼠骨髓MSC在體外微環(huán)境誘導下，橫向分化為角膜上皮細胞的情況。將分離培養(yǎng)的大鼠骨髓MSC與角膜基質細胞在Transwell體系中進行共培養(yǎng)，使用免

5、疫熒光技術檢測共培養(yǎng)前后細胞的分化情況。 結果 大鼠骨髓MSC可以在體外培養(yǎng)擴增，表現(xiàn)出很強的增殖潛能。免疫熒光染色顯示，原代培養(yǎng)的骨髓MSC CD29陽性，CD34、CD45和CK12為陰性，流式細胞儀顯示，CD29 陽性率為81.56 ％、CD34 為0.10 ％、CD44 為88.77 ％、CD45為0.17％，CD71為10.02％、CD90為98.43、CD133為1.56％。符合骨髓MSC的特征。骨髓MSC與