HGF促動脈血管形成的機理研究.pdf

1、目的:
　　 (1)確定Ad-HGF感染人股動脈內(nèi)皮細胞(HFAECs)的最佳感染強度,初步探討肝細胞生長因子(HGF)對HFAECs的Notch1和D114基因轉錄的調節(jié)作用,為進一步探討HGF與Noth信號通路的關系奠定基礎；
　　 (2)探討HGF對HFAECs的D114-Notch-Hey2信號通路的激活作用,及此通路激活后對HFAECs增殖和遷移能力的影響,從血管新生的角度來闡明Notch信號調控HGF促動脈形

2、成的作用及機制。
　　 (3)體外分離培養(yǎng)及鑒定人內(nèi)皮祖細胞(EPCs),為下一步從血管發(fā)生的角度探討HGF是否通過Notch信號通路調控祖細胞的分化來促動脈形成的機理提供體外細胞模型。
　　 方法:
　　 第一部分體外培養(yǎng)HFAECs,并用不同感染強度(MOI)(50,100,150,200,250,300pfu/cell)的攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒(Ad-GFP)轉染HFAECs,通過流式細胞儀(檢測

3、轉染效率)和MTT法(檢測細胞損傷程度)篩選和確定最佳MOI(高轉染效率且對細胞低損傷),作為下一步攜帶HGF基因的重組腺病毒(Ad-HGF)轉染細胞的最優(yōu)條件。Ad-HGF以最佳的MOI轉染HFAECs48h后,收集細胞上清,用ELISA法檢測HGF蛋白的表達水平,選取HGF表達水平最佳的細胞提取總RNA,通過反轉錄PCR(RT-PCR)來檢測Notch1和D114基因的轉錄水平。以轉染Ad-GFP的細胞作為對照。
　　 第二

4、部分基于前期研究,Ad-HGF以最佳MOI(200 pfu/cell)轉染HFAECs后0h、24h、48h、72h,分別收集細胞上清,用ELISA法檢測不同時間點HGF蛋白的表達水平；同時收集細胞提取總RNA,通過RT-PCR檢測不同時間點HFAECs中Notch1、D114和Hey2基因的轉錄水平；并采用MTT法和Transwell遷移實驗分別觀察HFAECs增殖和遷移能力的變化及與D114-Notch-Hey2信號通路激活的關系；

5、均以轉染Ad-GFP的細胞作對照。
　　 第三部分無菌、肝素抗凝,取臍血(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科提供,產(chǎn)婦均知情同意)作為EPCs的標本來源。用PBS等倍稀釋后取7 mL,臍血緩慢加入裝有3mL淋巴細胞分離液的離心管中,2000r/min離心25min,取云霧狀灰白色層單個核細胞。將細胞接種在人纖維粘連蛋白包被的6孔板中,培養(yǎng)于M-199培養(yǎng)基中。觀察貼壁細胞的形態(tài)變化；采用免疫細胞化學法鑒定EPCs。
　　 實驗數(shù)據(jù)采用

6、SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。
　　 結果:
　　 (1)以高轉染效率且對細胞低損傷為標準,確定最佳MOI為200pfu/cell；ELISA法檢測HGF表達水平的結果顯示,Ad-GFP組:(3.672±0.810)ng/ml；Ad-HGF組:(86.318±3.864)ng/ml。兩組比較轉染后48 h的HGF表達水平有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；
　　 (2)Ad-HGF轉染HFAECs48 h后,RT-

7、PCR結果顯示,通過紫外凝膠分析儀,可觀察到Ad-HGF組的Notch1和D114基因轉錄水平明顯上調；應用凝膠成像分析系統(tǒng)分析凝膠成像圖中目的基因的相對強度,結果顯示:Ad-GFP組和Ad-HGF組的數(shù)據(jù)分別為:D114,0.788±0.021和0.936±0.018；Notch1,0和0.458±0.023,兩組間進行單側t檢驗分析,P<0.05,有統(tǒng)計學意義。Ad-HGF組目的基因的相對強度明顯高于Ad-GFP組；
　　

8、(3)Ad-HGF轉染HFAECs不同時間段后,ELISA檢測HGF表達水平的結果顯示:Ad-HGF有效的導入了細胞,且HGF表達水平48 h內(nèi)有時間依賴性,72h開始下降；
　　 (4)Ad-HGF轉染HFAECs不同時間段后,RT-PCR的結果顯示:通過紫外凝膠分析儀,發(fā)現(xiàn)在0h僅能檢測到D114,基因的轉錄,在48 h內(nèi)Notch1和D114基因轉錄有時間依賴性,72h時Notch1基因轉錄已檢測不到,D114基因轉錄也明

9、顯減弱。Hey2的轉錄水平的變化與Notch1相一致。凝膠成像分析系統(tǒng)軟件處理結果與上述觀察結果一致；
　　 (5)在轉染Ad-HGF不同時間段的HFAECs的MTT試驗中初步觀察到,與對照組相比,在各個時間點Ad-HGF組的HFAECs的增殖和存活能力明顯增強；Transwell遷移實驗結果表明,遷移介質中不含HGF時,兩組細胞的遷移能力在各個時間點差異不明顯(p>0.05)；遷移介質中含HGF時,在24h、48h Ad-HG

10、F組細胞的遷移能力明顯強于對照組(p<0.05),且遷移能力在48h強于在24h但無統(tǒng)計學差異(p>0.05)；
　　 (6)EPCs體外培養(yǎng)形態(tài)觀察結果:細胞呈梭形,隨培養(yǎng)時間的延長呈“鋪路石”樣,與有關文獻報道相一致；
　　 (7)免疫細胞化學法鑒定EPCs的結果顯示:分離培養(yǎng)的細胞VEGFR-2和CD133均呈陽性反應,CD34反應較弱。
　　 結論:
　　 (1)HGF對HFAECs的Notch1