突變型PUMA對Hela細胞生物學(xué)功能的影響及其分子機制.pdf

1、p53上調(diào)凋亡調(diào)制物(p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)是一個具有強大促凋亡能力的BH3-only家族蛋白質(zhì)基因。PUMA通常低表達，但PUMA在許多病理性應(yīng)激因素可以通過一些轉(zhuǎn)錄因子(如p53、p73、E2F1和FOXO3a)上調(diào)其表達，借此誘導(dǎo)凋亡的反應(yīng)。近兩年研究發(fā)現(xiàn)一個新穎的調(diào)控機制:PUMA翻譯后調(diào)控。轉(zhuǎn)錄體PUMA-α編碼一個全長為193個氨基酸的蛋白，其中10號位絲氨酸

2、是最重要的磷酸化位點。當(dāng)10號位絲氨酸被丙氨酸取代可以減慢PUMA的降解、延長其半衰期、增加其穩(wěn)定性、增強細胞凋亡的能力。
　　本課題旨在探討針對PUMA蛋白10號位磷酸化位點突變的突變型與野生型PUMA蛋白對腫瘤細胞功能方面的差異及其可能的作用機制，為以后尋找更多PUMA蛋白翻譯后調(diào)控機制梁奠定實驗基礎(chǔ)。
　　目的:
　　觀察突變型PUMA與野生型PUMA對腫瘤細胞生物學(xué)功能方面的差異，并探討其誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制

3、，此為深入研究PUMA基因的抑癌功能及其翻譯后調(diào)節(jié)奠定實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　通過PCR方法從pCEP4-(HA)2-PUMA質(zhì)粒中擴增PUMA基因，并克隆到pIRES2-EGFP載體上，構(gòu)建PUMA真核表達載體pIRES2-EGFP-(HA)2-PUMA，利用定點突變技術(shù)構(gòu)建pIRES2-EGFP-(HA)2-PUMA-T28G質(zhì)粒，行PCR及測序鑒定;脂質(zhì)體分別將兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞，RT-PCR檢測PUMA的表

4、達，Western blot檢測突變型PUMA蛋白和標(biāo)簽蛋白的表達。
　　實驗隨機分為(1)空載質(zhì)粒組(2)野生型PUMA組(3)突變型PUMA組，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法分別將空載質(zhì)粒、野生型PUMA質(zhì)粒、突變型PUMA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人宮頸癌細胞中，轉(zhuǎn)染24h及48h后用RT-PCR和Western blot方法檢測各組PUMA表達情況;MTT及流式細胞術(shù)檢測野生型PUMA與突變型PUMA對細胞增殖抑制和促凋亡作用;應(yīng)用PI及Hoechs

5、t33342核染法觀察野生型PUMA與突變型PUMA對細胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變;野生型實驗組和突變型實驗組分別加入蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮后，Western blot方法檢測PUMA蛋白的表達變化情況;RT-PCR方法檢測PUMA及凋亡相關(guān)基因BAX、BCL-2的mRNA的表達變化;分光光度法檢測細胞的Caspase-3活性變化。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)PCR及測序結(jié)果表明，正確構(gòu)建野生型、突變型PUMA重組質(zhì)粒，PUMA基因第10

6、位氨基酸的第28～30位堿基由TCC突變?yōu)镚CC，其他堿基均無突變。野生型、突變型PUMA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞熒光顯微鏡觀察到綠色熒光表達。Western blot和RT-PCR均檢測出目的基因的高表達。提示PUMA基因及其定點突變載體均構(gòu)建成功。
　　在相同轉(zhuǎn)染效率的情況下，通過Western blot分析野生型PUMA組和突變型PUMA組的表達水平，結(jié)果表明突變型PUMA蛋白比野生型PUMA蛋白有一個更高的穩(wěn)定狀態(tài)。在表達

7、野生型和突變的PUMA細胞中我們通過實時定量PCR測量出同等量的PUMA mRNA，表明并不是由于轉(zhuǎn)染效率或不同的轉(zhuǎn)錄率導(dǎo)致的這種差異;接下來在轉(zhuǎn)染24h后誘導(dǎo)表達野生型和突變型的PUMA細胞中均加入蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮，然后對PUMA蛋白的降解進行檢測，結(jié)果表明，由于我們改變了PUMA蛋白的磷酸化位點，導(dǎo)致突變型PUMA蛋白降解延遲、半衰期延長，提示10號位絲氨酸磷酸化在決定PUMA降解率上具有重要的作用;野生型PUMA質(zhì)粒、突變

8、型PUMA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela細胞，在24、48小時后測定光密度值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒后，細胞存活率隨著時間的延長逐漸下降，且轉(zhuǎn)染突變型PUMA質(zhì)粒在24、48小時的存活率均比野生型PUMA質(zhì)粒組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這表明突變型PUMA對Hela細胞抑制增殖作用優(yōu)于野生型PUMA;通過PI及Hoechst33342染色后評價細胞核型，計算被轉(zhuǎn)染細胞中的早期和晚期凋亡細胞數(shù)。轉(zhuǎn)染24h后，轉(zhuǎn)染突變型PUMA組在GF

9、P陽性細胞中有22.5％的細胞出現(xiàn)凋亡，空載體組只有11.8％，相比轉(zhuǎn)染野生型PUMA組細胞中增加了約9.2％的細胞凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而隨著轉(zhuǎn)染PUMA在細胞中表達時間的延長，48h后突變型PUMA組比轉(zhuǎn)染野生型PUMA組細胞凋亡增加了約9.5％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。流式細胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著PUMA轉(zhuǎn)染時間的增加，野生型和突變型兩組腫瘤細胞的凋亡率均逐漸升高，并且突變型組細胞比野生型組細胞的凋亡率增加

10、更加明顯，這與核染色結(jié)果相似。
　　轉(zhuǎn)染突變型PUMA質(zhì)粒作用Hela細胞，在0、6、12、24、36、48小時，通過RT-PCR法檢測BCL-2和BAX表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，在PUMA表達逐漸增加的同時，BCL-2表達逐漸減少，而BAX表達無明顯變化。PUMA表達在48小時達到最高點，而BCL-2表達在48小時降低到最低點，不同時間點的PUMA和BCL-2表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).提示PUMA轉(zhuǎn)染細胞后降低

11、了BCL-2的活性，而PUMA對細胞內(nèi)BAX總量沒有明顯影響(P=0.060)。檢測Caspase-3各個時間組活性變化結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染突變型PUMA作用后，Caspase-3活性顯著升高，轉(zhuǎn)染6h組是0h組的(1.23±0.23)倍，轉(zhuǎn)染12h組是0h組的(2.05±0.17)倍，轉(zhuǎn)染24h組是0h組的(2.75±0.22)倍，轉(zhuǎn)染36h組是0h組的(3.32±0.24)倍，48h達到最高程度，是0h組的(4.21±0.21)倍，各組

12、與0h組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、PUMA具有抑制Hela腫瘤細胞增殖、促進其凋亡的作用，并且突變型比野生型PUMA對Hela腫瘤細胞的抑制作用及促凋亡功能更加明顯。
　　2、PUMA10號位點的絲氨酸是重要的磷酸化位點，絲氨酸被丙氨酸取代后增加了PUMA穩(wěn)定性，減慢了其降解、延長了其半衰期。
　　3、PUMA對Hela腫瘤細胞的促凋亡作用，是通過調(diào)控抗凋亡BCL-2表達，最終導(dǎo)