兩個視網膜色素變性家系的分子遺傳學研究.pdf

1、視網膜色素變性是一類遺傳性視網膜疾病，世界范圍內平均約有1/3500的患病率，是成年人失明的主要原因之一。視網膜色素變性患者通常在早期出現夜盲，漸行性視野喪失；到末期階段，往往在中年之后，患者的中心視野嚴重受損時，可導致永久性失明。眼底檢查中通?？梢娨暰W膜血管變細，眼底分布有色素沉著，視盤呈蒼白色等典型特征。目前，臨床上對視網膜色素變性尚沒有有效的預防與治療方法。
　　 視網膜色素變性表現出高度的臨床以及遺傳異質性。遺傳上，主要

2、可表現為常染色體顯性（30-40%），常染色體隱性（50-60%），X 染色體連鎖（5-15%）等三種方式的遺傳，少數視網膜色素變性的病例不屬于孟德爾遺傳模式，如雙基因遺傳以及線粒體遺傳等。有些基因的不同突變，在不同的家系中還可以表現為不同的遺傳模式。雖然已經有很多相關基因或位點被報道，但是，迄今為止，仍然有60%的視網膜色素變性病例沒有找到致病基因。發(fā)現新的視網膜色素變性基因，對于進行基因診斷、理解疾病發(fā)展的分子機制以及發(fā)現有效的治療

3、方法有著積極意義。
　　 本課題主要對兩個中國人視網膜色素變性家系的遺傳因素進行研究。通過連鎖以及單倍型分析先在染色體上確定相關致病基因的位置；接著運用DNA 直接測序法來分析該基因是否含有導致疾病的突變，以及突變是否在家系中共分離；再應用高分辨率熔解曲線分析等方法，分析突變是否存在于正常人群中。
　　 我們首先對一個來自山東的常染色體隱性遺傳的家系進行研究。通過連鎖分析和單倍型分析，我們發(fā)現該家系的致病基因可能與新發(fā)現

4、的arRP位點RP26 緊密連鎖，而排除了其它隱性遺傳RP基因致病的可能性。通過對RP26基因CERKL的整個編碼序列，以及外顯子與內含子交接區(qū)的測序，發(fā)現病人的第一個外顯子中存在一個插入突變，即在CERKL cDNA的第156位核苷酸和157 核苷酸之間插入了一個T（c.156_157insT）；病人另一條染色體上的第5外顯子中則發(fā)現缺失了一個T，即CERKL cDNA的第758位核苷酸T 缺失（c.758delT）。進一步對整個家系

5、的測序分析結果顯示先證者的母親含有c.156_157insT突變，先證者的父親則含有c.758delT突變，兩個姐妹則分別從其父母中遺傳到兩個正常的等位型，而先證者及其兩個兄弟均得到其父母兩個突變的等位型，提示CERKL 兩個復合型雜合突變c.156_157insT和c.758delT 是該家系三位患者患有視網膜色素變性的遺傳基礎。在隨后進行的HRM結果表明，這兩個突變在100 多位正常人群中不存在。
　　 CERKL的c.15

6、6_157insT和c.758delT突變均屬于移碼突變，顯著改變了其編碼蛋白的讀碼框。C.156_157insT 由于T的插入，正好產生一個密碼子TGA，使得該基因的編碼產物提前終止，產生只有52個氨基酸的異常蛋白；而c.758delT突變由于第758位T的缺失，也改變了其后的閱讀框，不僅將原來的第253-258 氨基酸METDRI 序列，改變?yōu)楫惓５腞KQTES，還在第259位產生一個終止密碼子TGA，因而產生一個只有258個氨基酸

7、的異常蛋白，而不是正常CERKL基因編碼的含532個氨基酸的正常蛋白質。
　　 目前為止，CERKL中只有三個突變被報道，并都是在同血緣關系的家系中發(fā)現的。而我們發(fā)現的這兩個新突變不僅是在中國人RP家系中的首次報道，而且是世界上第一次發(fā)現，CERKL的復合型雜合突變，可以在非血緣關系的家庭中，引起隱性遺傳的視網膜色素變性。我們的研究豐富了CERKL突變引起視網膜色素變性的遺傳突變譜，對于視網膜色素變性的基因診斷，以及認識該基因的

8、功能，和視網膜色素變性發(fā)病的分子病理機制具有一定的意義。
　　 為探討這兩個CERKL突變引起視網膜色素變性的分子機制，我們構建了含野生型和突變型CERKL的pEGFP-CERKL 載體，對突變的細胞學效應進行分析。將重組載體轉染HeLa細胞，用共聚焦顯微鏡觀察野生型和突變型CERKL的亞細胞定位，發(fā)現突變后的CERKL 蛋白在細胞中的定位有明顯變化。
　　 本論文還對一個在來自湖北省的常染色體顯性遺傳家系進行分子遺傳學

9、研究，通過連鎖分析我們排除了其它常染色體顯性遺傳的RP基因，發(fā)現該家系的致病基因與RP4 緊密連鎖；運用DNA 直接測序法對RP4基因RHO 整個編碼區(qū)的測序，發(fā)現患者的RHO基因中有一個堿基替換突變，即：c.C5271T，該突變導致RHO 蛋白第347個氨基酸由脯氨酸變?yōu)榱涟彼幔╬.P347L）。該突變在家系中與疾病共分離，提示RHO的p.P347L 為該家系患有adRP的遺傳基礎。我們還對家系中兩個尚未發(fā)病的個體進行了基因診斷。和其