甘蔗梢腐病原菌——串珠鐮刀菌分子生物學(xué)研究初探.pdf

1、串珠鐮刀菌(Fusarium moniliformis)引起的甘蔗梢腐病是甘蔗生產(chǎn)過(guò)程中一種常見(jiàn)病害。1921在印度尼西亞爪哇首次報(bào)道了該病。目前幾乎所有甘蔗生產(chǎn)國(guó)和地區(qū)都有該病發(fā)生。并引起了比較的嚴(yán)重的病害，造成了一定的損失(張國(guó)棉，2009)。
　　 本文研究了該病病原菌串珠鐮刀菌的原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化技術(shù)。文中對(duì)液體高度、離心力、離心管大小、離心機(jī)升速與減速的快慢、離心管穴傾角、不同洗滌劑等因素對(duì)原生質(zhì)體活性、沉淀松緊度及壁

2、效應(yīng)的影響進(jìn)行了研究；文中還研究了不同復(fù)蘇時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體再生的影響，以及不同酶濃度及不同酶對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響；文中也介紹了一種離心管平衡的方法。
　　 為了了解各個(gè)基因的各種功能，筆者使用TrpC啟動(dòng)子+hph(Hygromycinphosphtotransferase，hph))基因的ORF的DNA PCR擴(kuò)增片段對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并對(duì)轉(zhuǎn)化子插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行克隆。共獲得三個(gè)轉(zhuǎn)化子的插入片段側(cè)翼序列。其它擴(kuò)增到的側(cè)翼序

3、列則主要為載體上的序列和用于轉(zhuǎn)化的片段間互相搭橋形成的序列。因此用該法進(jìn)行隨機(jī)插入仍要求改進(jìn)。
　　 MAPK途徑與真菌生長(zhǎng)發(fā)育、有性生殖、分生孢子產(chǎn)生等相關(guān)。絲氨酸蛋白酶是分解蛋白質(zhì)的酶。病原菌分泌的絲氨酸蛋白酶，可能是病原菌的毒性因子。這兩類(lèi)基因都可能與病原菌致病相關(guān)。為了尋找與致病相關(guān)基因，本文對(duì)串珠鐮刀菌的MAPK途徑基因和絲氨酸蛋白酶基因進(jìn)行了研究。
　　 通過(guò)同源重組進(jìn)行基因敲除，作者共獲得于A149三個(gè)MA

4、PK途徑基因的敲除突變體。對(duì)這些突變體進(jìn)行表型分析發(fā)現(xiàn)：FVEG_02618.3敲除突變體生長(zhǎng)速度沒(méi)有變化；菌落形態(tài)沒(méi)有太大變化；對(duì)鹽分比較敏感；致病性略有下降；產(chǎn)孢沒(méi)有太大變化。FVEG_03043.3的敲除突變體菌落生長(zhǎng)明顯變慢，為野生型的三分之一；菌落顏色加深；當(dāng)氯化鈉濃度為0.5M時(shí)，菌落生長(zhǎng)速度較在氯化鈉濃度為0M時(shí)生長(zhǎng)速度加快，但比野生型仍然減慢；分生孢子產(chǎn)生情況沒(méi)有太大變化；致病性也沒(méi)有太大變化。FVEG_04168.3的

5、敲除突變體生長(zhǎng)速度、菌落形態(tài)與野生型相比沒(méi)有差異；突變體的致病性沒(méi)有變化。分生孢子產(chǎn)生也沒(méi)有變化。突變體對(duì)鹽濃度極敏感。在含0.5M的氯化鈉下培養(yǎng)基就不生長(zhǎng)。作者獲得了FN28一個(gè)絲氨酸蛋白酶基因FVEG_00212.3的敲除突變體。表型分析說(shuō)明敲除突變體的生長(zhǎng)速度沒(méi)有太大變化，菌落顏色明顯加深，氣生菌絲明顯減少，菌絲易早期死亡，分生孢子產(chǎn)生沒(méi)有太大變化，致病性也沒(méi)有太大變化。作者也獲得了該基因的過(guò)表達(dá)突變體。過(guò)表達(dá)突變體致病性、產(chǎn)孢、