膜翅目昆蟲(chóng)螺原體的研究及我國(guó)部分螺原體遺傳多樣性分析.pdf

1、螺原體(spiroplasma)是一類(lèi)基本形態(tài)為螺旋狀、無(wú)細(xì)胞壁的原核微生物,也是原核生物中能獨(dú)立生活和自我復(fù)制的最簡(jiǎn)單的生命形式,它的基因組非常小(780-2220kb)。螺原體沒(méi)有細(xì)胞壁和鞭毛,僅靠單層膜包裹整個(gè)細(xì)胞,常作為研究運(yùn)動(dòng)的模式生物。中國(guó)有關(guān)螺原體的研究非常少,研究力量十分薄弱,調(diào)查我國(guó)昆蟲(chóng)螺原體的存在情況,收集昆蟲(chóng)螺原體資源,將有助于充分認(rèn)識(shí)和利用這類(lèi)重要的微生物資源。本研究于2009年在我國(guó)5個(gè)省,特別是南京地區(qū)采集3

2、00多種不同種類(lèi)的昆蟲(chóng)進(jìn)行螺原體分離,結(jié)果主要在膜翅目蜜蜂總科和蛛蜂總科的昆蟲(chóng)中分離到8株螺原體,分別是MUF0901分離自木蜂、STF0901和STF0902分離自四條蜂、QYF0901分離自切葉蜂、ZHUF0901分離自蛛蜂、MF0903、MF0904和MF0905均分離自蜜蜂。之后對(duì)分離菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、基本生物學(xué)、分子生物學(xué)及血清學(xué)特性的研究,已初步確定分離菌株的分類(lèi)地位。此外,還對(duì)我國(guó)部分螺原體資源進(jìn)行遺傳多樣性分析,以期調(diào)查我

3、國(guó)螺原體資源的豐富度。
　　 應(yīng)用暗視野顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察螺原體形態(tài),并對(duì)分離菌株的運(yùn)動(dòng)性、基本生物學(xué)特性及致病性進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌株在R2液體培養(yǎng)基中都生長(zhǎng)良好,并呈翻滾式運(yùn)動(dòng),能通過(guò)孔徑為0.22μm、0.45μm的微孔濾膜；分離菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期都呈典型的螺旋狀；在固體培養(yǎng)基上都呈圓形或顆粒狀菌落,有些可見(jiàn)衛(wèi)星菌落；都能利用葡萄糖、D-果糖作為碳源；代謝精氨酸的能力稍有差異；都不能利用尿素,在含氨芐青霉素鈉(2

4、000 U/ml)的R2液體培養(yǎng)基中都生長(zhǎng)良好；毛地黃皂苷能抑制這些菌株的生長(zhǎng),產(chǎn)生較大的抑菌圈,以上這些特征說(shuō)明分離菌株均符合Spiroplasma屬的描述。在最適生長(zhǎng)溫度下,所有菌株的生長(zhǎng)曲線都分為延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期4個(gè)典型的生長(zhǎng)階段,但它們的生長(zhǎng)速度有所不同；除菌株MF0905外所有分離菌株的生長(zhǎng)pH范圍比較寬泛,最適pH一般是7.2或7.6。經(jīng)基本生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)分離菌株MF0905、ZHUF0901明顯區(qū)別于其它6株

5、菌。通過(guò)飼喂新鮮菌液接種法研究了2株特殊螺原體MF0905、ZHUF0901對(duì)意蜂(Apis mellifera)的致病性,發(fā)現(xiàn)感染菌株ZHUF0901的意蜂(Apis mellifera)在第6 d出現(xiàn)類(lèi)似“爬蜂病”癥狀,A.mellifera校正死亡率為26.15％,與對(duì)照(接種培養(yǎng)基)相比達(dá)到5％水平顯著差異。而感染菌株MF0905的A.mellifera校正死亡率僅為2.25％,在飼喂過(guò)程中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)典型的“爬蜂病”癥狀,在5％

6、顯著水平下與對(duì)照(接種培養(yǎng)基)相比差異不顯著。推斷分離自蛛蜂的菌株ZHUF0901對(duì)意蜂具有較強(qiáng)的致病性,而分離自意蜂的菌株MF0905對(duì)意蜂的致病力較弱。
　　 采用細(xì)菌試劑盒提取螺原體DNA,然后對(duì)16S rDNA、ITS、rpoB、parE、spiralin等5個(gè)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序,之后結(jié)合其它已報(bào)道的螺原體屬內(nèi)所有的種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明spiralin基因可能不適合作為一個(gè)遺傳marker在種水平上進(jìn)行螺原

7、體分類(lèi)鑒定；基于16S rDNA、ITS、rpoB、parE等序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示:ZHUF0901與S.apis聚為一枝；MF0905與S.clarkii聚成一類(lèi)；其它6株菌都與Spiroplasma melliferum聚類(lèi),它們的自展值都很高,因此推斷ZHUF0901可能是S.apis,MF0905可能是S.clarkii,其它6株菌STF0901、OYF0901、MUF0901、MF0903、STF0902、MF0904都屬

8、于S.melliferum,但需要用血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步證明。
　　 通過(guò)免疫新西蘭大白兔獲得了ZHUF0901、MF0905多克隆抗體,利用實(shí)驗(yàn)室已有的抗體及新制備的抗體,對(duì)分離的8株螺原體分別進(jìn)行了生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)、代謝抑制試驗(yàn)、菌體變形試驗(yàn)。3個(gè)血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果一致表明:在用已知的S.melliferum抗體與分離菌株反應(yīng)時(shí),ZHUF0901、MF0905表現(xiàn)弱反應(yīng),而其它6株菌則表現(xiàn)較強(qiáng)的反應(yīng)；在用ZHUF0901、MF0905抗

9、體進(jìn)行交叉互補(bǔ)試驗(yàn)時(shí),這2株螺原體都只分別與自身的抗體表現(xiàn)較強(qiáng)的特異性反應(yīng)并產(chǎn)生較大的抑菌圈,而與其它菌株的抗體反應(yīng)較弱。以上結(jié)果表明,菌株MUF0901、STF0901、STF0902、OYF0901、MF0903、MF0904與S.melliferum親緣關(guān)系較近,屬于S.melliferum類(lèi)群,而ZHUF0901、MF0905不屬于 S.melliferum。
　　 蜜蜂螺原體是蜜蜂螺原體病(spiroplasmosis

10、)的致病菌,也是蜜蜂爬蜂病的主要病原之一。本研究以蜜蜂螺原體標(biāo)準(zhǔn)菌株S.melliferum CH-1作為包被抗原,建立了S.melliferum CH-1的間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)檢測(cè)方法。利用建立的ELISA標(biāo)準(zhǔn)化程序?qū)Ψ蛛x菌株進(jìn)行了分類(lèi)鑒定,結(jié)果顯示ELISA方法與上述傳統(tǒng)的血清學(xué)方法所得結(jié)果一致,而且結(jié)果更加準(zhǔn)確、具體。此方法的建立也為今后蜜蜂螺原體快速檢測(cè)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DN

11、A(RAPD)技術(shù),對(duì)實(shí)驗(yàn)室20株昆蟲(chóng)及植物花螺原體的分類(lèi)、宿主種類(lèi)、菌株之間的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。從40條隨機(jī)引物中篩選出34條引物,共擴(kuò)增出5301條條帶,其中4954條表現(xiàn)出多態(tài)性,多態(tài)性條帶占93.45％。根據(jù)螺原體個(gè)體間的相似性,用UPGMA法聚類(lèi)分析。結(jié)果表明,分離菌株在60％相似性水平上可聚類(lèi)分為5個(gè)分枝,其中A1分枝包括5個(gè)菌株,除1株分離自昆蟲(chóng)外其余4株都分離自植物花；A3分枝主要包括的是膜翅目昆蟲(chóng)螺原體；A4分枝包

12、括了3個(gè)目的昆蟲(chóng)螺原體；B、C都僅包括一個(gè)菌株。以上結(jié)果初步說(shuō)明我國(guó)螺原體的遺傳多樣性豐富。
　　 本研究通過(guò)對(duì)8株昆蟲(chóng)螺原體進(jìn)行形態(tài)學(xué)、基本生物學(xué)、分子生物學(xué)以及血清學(xué)特性等方面的研究。初步推斷分離自蛛蜂的ZHUF0901可能是Spiroplasma apis,分離自蜜蜂的MF0905可能是Spiroplasma clarkii,其它6株菌屬于Spiroplasma melliferum。這是首次在我國(guó)發(fā)現(xiàn)S.apis,也是首