甘肅省豬繁殖障礙性疾病病毒性病原的分子流行病學(xué)調(diào)查及HP-PRRSV DNA疫苗的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是以懷孕母豬繁殖障礙及各年齡階段豬呼吸道疾病為主要特征的豬傳染病。2006年以來(lái)，我國(guó)爆發(fā)了高致病性PRRS(highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)，使我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)蒙受巨大經(jīng)濟(jì)損失。其病原高致病性PRRS病毒(highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)在nsp2蛋白不連續(xù)

2、缺失30個(gè)氨基酸，在我國(guó)豬場(chǎng)廣泛流行，成為引起母豬繁殖障礙和仔豬死亡的主要病原之一。
　　 針對(duì)2007-2010年甘肅省豬場(chǎng)發(fā)生的母豬繁殖障礙性疾病，我們?cè)O(shè)計(jì)了PRRSV nsp2和GP5基因特異性引物，檢測(cè)PRRS在甘肅省發(fā)病情況，結(jié)果大多數(shù)臨床樣品呈PRRSV陽(yáng)性。為了進(jìn)一步研究我國(guó)PRRSV的遺傳變異情況，本研究選取其中7株分離株進(jìn)行了PRRSV全基因組序列測(cè)定，并將其與國(guó)內(nèi)外分離株進(jìn)行比較分析。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，國(guó)

3、內(nèi)PRRSV毒株可分成4個(gè)亞群，經(jīng)典毒株主要位于第Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亞群，而高致病性毒株位于第Ⅳ亞群，該亞群與傳統(tǒng)疫苗株RespPRRS MLV和CH-1R的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這些疫苗在預(yù)防高致病性PRRSV方面可能起不到理想的效果。第Ⅳ亞群中的高致病性PRRSV的nsp2蛋白均呈現(xiàn)不同程度的缺失，共有4種缺失類(lèi)型的毒株，其中以不連續(xù)缺失30個(gè)氨基酸的高致病性毒株為主，這些毒株構(gòu)成了從2006年至今在我國(guó)流行的優(yōu)勢(shì)毒株。本研究分離的07N、128、

4、TS、XB和XIN株屬于第Ⅳ亞群，具備高致病性PRRSV的分子特征；XJ株屬于第Ⅲ亞群，為經(jīng)典毒株；QD株在全基因組序列和nsp2蛋白序列分群中位于第1亞群，在OP5、M和N蛋白序列分群中位于第Ⅳ亞群，推測(cè)QD株可能是經(jīng)典毒株和高致病性毒株的重組毒株。各亞群均有各自獨(dú)有的氨基酸序列特征，高致病性PRRSV GP5和M蛋白中的毒力相關(guān)位點(diǎn)保持了強(qiáng)毒株的序列特征，并且其中和表位發(fā)生變異，糖基化位點(diǎn)增多并向其下游的中和表位靠近，可能遮蔽中和表

5、位，延遲產(chǎn)生中和抗體，從而逃避宿主免疫反應(yīng)。以上結(jié)果表明，在甘肅省豬繁殖障礙性疾病發(fā)病豬場(chǎng)中PRRSV感染很普遍，并且高致病性毒株仍是危害甘肅乃至全國(guó)的主要PRRSV毒株，高致病性毒株高度同源，位于同一亞群，具有逃避宿主免疫的潛質(zhì)，與之親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的原有傳統(tǒng)疫苗難以防治，因此加強(qiáng)對(duì)PRRSV的分子流行病學(xué)調(diào)查和研制新型有效疫苗勢(shì)在必行。
　　 為了調(diào)查甘肅省豬繁殖障礙性疾病中其他病毒性病原的存在情況，本研究設(shè)計(jì)了幾對(duì)特異性引物，

6、分別用于檢測(cè)臨床樣品中的豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)、豬偽狂犬病毒(PRV)以及豬瘟病毒(CSFV)等。通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行PCR或RT-PCR，結(jié)果有2份樣品呈PPV陽(yáng)性，有5份樣品呈PCV2陽(yáng)性。為了進(jìn)一步研究PPV及PCV2的遺傳變異情況，本研究根據(jù)GenBank中收錄的PPV和PCV2的全基因組序列，分別設(shè)計(jì)了擴(kuò)增PPV全基因組的引物以及擴(kuò)增PCV2全基因組的引物，對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行序列測(cè)定和分析。PPV的系統(tǒng)進(jìn)化分析

7、結(jié)果表明我國(guó)豬細(xì)小病毒主要分成4個(gè)主要的亞群，本研究分離的LZ株屬于Ⅱ群，是最近幾年來(lái)在中國(guó)常見(jiàn)的PPV分離株；而本研究分離的JY株屬于Ⅲ群，該群是由德國(guó)PPV分離株構(gòu)成的，這是我國(guó)首次分離到該群的PPV毒株。通過(guò)對(duì)PCV2的遺傳進(jìn)化分析，我們發(fā)現(xiàn)PCV2主要分成5個(gè)亞群，本研究分離的124株和XIN株屬于2b亞群，XJ株和XB株屬于2d亞群，而TS株屬于2e亞群。以上分析結(jié)果表明，甘肅省豬繁殖障礙性疾病的病原比較復(fù)雜，并且同一種病原也

8、存在不同的亞群，表明我們應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)豬繁殖障礙性疾病中各種病原的調(diào)查和分析。
　　 疫苗預(yù)防是阻止傳染病在畜群蔓延的重要手段。隨著HP-PRRS疫情的爆發(fā)，亟需一種能夠有效預(yù)防該病的疫苗，然而傳統(tǒng)的滅活疫苗往往不能給豬群提供足夠的免疫保護(hù)力。本研究構(gòu)建了共表達(dá)GP5/M蛋白的DNA疫苗以及對(duì)GP5蛋白進(jìn)行修飾的△GP5/M DNA疫苗。小鼠試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種疫苗都能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的ELISA抗體，也能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生病毒特異性的