發(fā)酵過程控制_第1頁
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文檔簡介

1、發(fā)酵工程 課件 Fermentation Engineering,第五章 發(fā)酵過程控制(二),主講人:夏帆,歡迎,光臨,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,2,教學目的:了解發(fā)酵過程pH變化的原因;掌握pH對發(fā)酵的影響;掌握pH的控制策略。 教學重點、難點:pH對發(fā)酵的影響;pH的控制策略,特別是如何分階段控制pH。,第2節(jié) 發(fā)酵過程的pH控制(2學時),2024年3月23日星

2、期六,3,內 容 速 覽,,二、pH對發(fā)酵的影響,一、發(fā)酵過程pH變化的原因,,,,四、pH的控制策略,,pH控制,1、調節(jié)好基礎料的初始pH2、在基礎料中加入維持pH的物質3、通過補料調節(jié)pH 4、當補料與調pH發(fā)生矛盾時,加酸堿調pH 5、不同調pH方法的影響6、發(fā)酵的不同階段采取不同的pH值,,,三、pH測量,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,4,不同種類微生物,對pH要求不同;,,酵 母:

3、pH 3.8-6.0,細 菌:pH 6.5-7.5,霉 菌:pH 4.0-5.8,放線菌:pH 6.5-8.0,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,5,同種微生物對pH變化的反映不同,,pH 3.5-5.0 生長良好,不易染菌;,pH >5.0時,易染細菌;,pH <3.0時,生長受抑制,易自溶;,如,石油代蠟酵母,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,6,,一、發(fā)酵過程引起pH變化的原

4、因,1、基質代謝,2、產物形成,3、菌體自溶,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,7,,1、基質代謝,(1)糖代謝 特別是快速利用的糖,分解成小分子酸、醇,使pH下降。糖缺乏,pH上升,是補料的標志之一。(2)氮代謝 當氨基酸中的-NH2被利用后pH會下降;尿素被分解成NH3,pH上升;NH3利用后pH下降;當碳源不足時氮源當碳源利用pH上升。(3)生理酸性物質、生理堿性物質 利用后pH會下降或上升。,

5、2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,8,2、產物形成,某些產物本身呈酸性或堿性,使發(fā)酵液pH變化。如有機酸類產生使pH下降紅霉素、潔霉素、螺旋霉素等抗生素呈堿性,使pH上升。,3、菌體自溶,pH上升;發(fā)酵后期,pH上升。,,一、發(fā)酵過程引起pH變化的原因,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,9,(1)下降①培養(yǎng)基中C/N不當,有機酸積累;②消沫油加得過多;③生理酸性物質過多;(2)上升①

6、C/N比例不當,N過多,氨基氮釋放;②生理堿性物質過多;③中間補料時堿性物加入量過大;,引起發(fā)酵液pH值變化的常見因素,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,10,,例1 pH對林可霉素發(fā)酵的影響,林可霉素發(fā)酵開始,葡萄糖轉化為有機酸類中間產物,發(fā)酵液pH下降,待有機酸被生產菌(林可鏈霉菌)利用,pH上升。(如下頁圖所示) 若不及時補糖、(NH4)2SO4或酸,發(fā)酵液pH可迅速升到8.0以上,阻礙或抑制

7、某些酶系,使林可霉素增長緩慢,甚至停止。,1、實例,,,,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,11,林可霉素(潔霉素),對革蘭陽性球菌有較好作用,特別對厭氣菌、金葡菌及肺炎球菌有高效。作用機制:主要抑制細菌細胞蛋白質的合成 臨床:主要用于敏感菌引起的各種感染,如肺炎、腦膜炎、心內膜炎、蜂窩織炎、扁桃體炎、丹毒、癤及泌尿系統(tǒng)感染等。 可進入骨組織中,和骨有特殊親和力,故特別適用于厭氣菌引起的感染及金葡菌性骨髓炎。,

8、,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,12,pH對林可霉素發(fā)酵的影響,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,13,對照罐發(fā)酵66小時pH達7.93,以后維持在8.0以上至115小時,菌絲濃度降低,NH2-N升高,發(fā)酵不再繼續(xù)。 發(fā)酵15小時左右,pH值可以從滅菌后的6.5左右下降到5.3,調節(jié)這一段的pH值至7.0左右,以后自控pH,可提高發(fā)酵單位。,pH對林可霉素發(fā)酵的影響,2024年

9、3月23日星期六,14,例2:培養(yǎng)基初始pH值對漆酶分泌的影響,pH在5~7范圍內產酶最高,,,,(三色革裥菌),2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,15,,2、pH對發(fā)酵的影響,(2)pH影響酶的活性,(3)pH值影響微生物細胞膜所帶電荷的改變,(4)pH值影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離,(1)影響菌體的生長,(5)pH影響代謝方向,(6)影響產物穩(wěn)定性,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,1

10、6,舉例:產黃曲霉的細胞壁的厚度就隨pH值的增加而減?。浩渚z直徑在pH6.0時為2~3 μm;pH7.4時為2~18 μm,并呈膨脹酵母狀;pH值下降后菌絲形態(tài)又會恢復正常。,(1)影響菌體的生長,,2、pH對發(fā)酵的影響,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,17,,2、pH對發(fā)酵的影響,(2)pH影響酶的活性 當pH值抑制菌體某些酶 的活性時使菌的新陳代謝受阻。,(3)pH值影響微生物細胞膜所帶電

11、荷的改變 從而改變細胞膜的透性,影響微生物對營養(yǎng)物質的吸收及代謝物的排泄,因此影響新陳代謝的進行。,(4)pH值影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離 從而影響微生物對這些物質的利用 。,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,18,(5)pH影響代謝方向 pH不同,往往引起菌體代謝過程不同,使代謝產物的質量和比例發(fā)生改變。例如黑曲霉在pH2~3時發(fā)酵產生檸檬酸,在pH近中性時,

12、則產生草酸。 谷氨酸發(fā)酵,在中性和微堿性條件下積累谷氨酸,在酸性條件下則容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。,,2、pH對發(fā)酵的影響,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,19,pH不同,微生物代謝產物不同。,,黑曲霉,pH:2-3,檸檬酸 發(fā)酵,pH:7.0,草酸發(fā)酵,,谷氨酸菌,pH:7-8,GA發(fā)酵,pH:5.0-5.8,谷氨酰胺發(fā)酵,,釀酒酵母,pH:4.5-5.0-3,乙醇 發(fā)酵,pH:8.0,

13、甘油發(fā)酵,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,20,β-內酰胺抗生素噻納霉素的發(fā)酵中,pH在6.7~7.5之間時抗生素的產量相近,高于或低于這個范圍,合成受到抑制。在這個pH值范圍內,噻納霉素的穩(wěn)定性未受到嚴重影響;但pH>7.5時,穩(wěn)定性下降,半衰期縮短,發(fā)酵單位也下降。青霉素在堿性條件下發(fā)酵單位低,也與青霉素的穩(wěn)定性有關。,(6)影響產物穩(wěn)定性,,2、pH對發(fā)酵的影響,21,,3、pH在微生物培養(yǎng)的不同階段有

14、不同的影響,pH對菌體生長影響比產物合成影響小,四環(huán)素:菌體生長最適pH6.0~6.8,產物合成最適 pH5.8~6.0 。青霉素:菌體生長最適pH3.5~6.0,產物合成最適 pH7.2~7.4 。,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,22,,,4、最佳pH的確定,配制不同初始pH的培養(yǎng)基,搖瓶考察發(fā)酵情況,pH對產海藻酸裂解酶的影響,2024年3

15、月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,23,pH對海藻糖水解酶產生的影響,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,24,pH對谷氨酰胺轉氨酶活力的影響,菌體干重(g/L),,,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,25,三、pH測量,1、取樣罐外測量,試紙法 (精密級)酸度計法,罐外取樣測量不利于實現(xiàn)自動化管理,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,26,2、在線測量,發(fā)酵用復合p

16、H電極 + pH顯示儀表,pH測量原理圖,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,27,發(fā)酵用復合pH電極,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,28,發(fā)酵用復合pH電極要求,?能高溫滅菌,過高的溫度將對玻璃膜材質和參比電極性質產生影響,造成不可逆轉的破壞。,?具有長時間的穩(wěn)定性,應保證轉換系數(shù)和不對稱電位能適應發(fā)酵周期長、中途不能更換和不能標定的要求,? 外加不銹鋼護套或工程塑料護套后安裝于罐內,

17、?要求一定的液絡部流通,維持的液接界電位穩(wěn)定,防止使用過程中液絡部被含硫物、蛋白質和非水溶液污染,造成電極測量漂移,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,29,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,30,pH顯示儀表,應具有較高的輸入阻抗(1011-1012 ?)并具有自動或手動的溫度補償功能,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,31,1、調節(jié)好基礎料的初始pH 基礎料中若

18、含有玉米漿,pH呈酸性,必須調節(jié)pH。若要控制滅菌后pH在6.0,滅菌前pH往往要調到6.5~6.8。,2、在基礎料中加入維持pH的物質如CaCO3 ,或具有緩沖能力的試劑,如磷酸緩沖液等。,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,32,在發(fā)酵過程中根據(jù)糖氮消耗需要進行補料。在補料與調pH沒有矛盾時采用補料調節(jié)pH。如(1)調節(jié)補糖速率,調節(jié)空氣流量來調節(jié)pH。 (2) 當NH2-N低,pH低時補氨水;

19、 當NH2-N低,pH高時補(NH4)2SO4。 通過補料調節(jié)pH值既調節(jié)了培養(yǎng)液的pH值,又可補充營養(yǎng),進一步提高發(fā)酵產率。,4、當補料與調pH發(fā)生矛盾時,加酸堿調pH,3、通過補料調節(jié)pH,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,33,應急措施:改變攪拌轉速或通氣量,以改變溶解氧濃度,控制有機酸的積累量及其代謝速度;改變溫度,以控制微生物代謝速度;改變罐壓及通氣量,降低CO2的溶解量;

20、改變加油或加糖量等,調節(jié)有機酸的積累量;,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,34,分別在4種緩沖介質中,于pH 6.50一9.50測定天冬酰胺酶酶活力。1 甘氨酸介質在pH8.0 時酶活力最高;2 硼酸在pH8.50,酶活力最高;3 磷酸在pH 8.50,酶活力最高;4 Tris在pH 8.50,酶活力最高;酶活1>2>4>3,5、不同調pH方法的影響,天冬酰胺酶,pH,三羥甲基氨基甲烷,35,

21、“1”——CaC03 “2”——尿素 “3”——CaC03+尿素,不同pH控制方式對目的突變株ISw330異亮氨酸搖瓶發(fā)酵的影響,黃色短桿菌誘變,36,例:pH對L-異亮氨酸發(fā)酵的影響(天津科技大學,2004),菌株最適生長pH控制在6.8~7.0,6、發(fā)酵的不同階段采取不同的pH值,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,37,不同pH值對菌體的形態(tài)影響很大,當pH值高于7.5時,菌體易于老化,呈現(xiàn)球狀;當p

22、H值低于6.5時菌體同樣受抑制,易于老化。在6.9左右時,菌體處于生長期,呈“八”字形狀并占有絕對的優(yōu)勢;而在7.2左右時,菌體是處于產酸期,呈現(xiàn)長的橢圓形。,38,pH6.9時,菌體生長旺盛,pH7.15時,對菌體的產酸有利。采用階段pH控制模式進行發(fā)酵,在發(fā)酵中前期控制pH6.9,到48h后pH值為7.15,到80h后pH值為7.25。產率22.27g/L,產酸率提高11.25%。,,,,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生

23、物工程系,39,例:克拉維酸(CA)發(fā)酵中pH變換控制,問題的提出: CA產生菌棒狀鏈霉菌在pH低時生長受抑制,在pH高時克拉維酸要分解。,用2.5升罐進行的不控制pH的發(fā)酵發(fā)現(xiàn),前期由于微生物產生的酸性副產物和有機酸使pH降至6.5。在達到最高細胞濃度后,pH開始從6.5升至8.3。產量達最高水平時,pH不再升高。在發(fā)酵終止時,pH再次升至8.5。隨著pH升高,CA迅速分解。,國外醫(yī)藥抗生素分冊,2004年第1期,,2024年3月23

24、日星期六,長江大學生科院生物工程系,40,克拉維酸,廣譜β-內酰胺酶抑制劑 僅有微弱的抗菌活性 ,單獨應用無效 可使不耐β—內酰胺酶的抗生素如青霉素G、氨芐西林、阿莫西林或頭孢菌素Ⅱ(頭孢噻吩)的抗茵譜增廣,抗菌活性增強 金葡菌、大腸桿菌、肺炎桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、流感桿菌及脆弱桿菌等,,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,41,pH控制對細胞量和CA產量的影響研究,控制 pH6.0時,細胞生長受抑制

25、,CA產生完全被抑制,產量很小。,分別控制pH為6.0,7.0,8.0測定菌的生長和產物合成。,取發(fā)酵液10 mL于離心沉淀管中,在3500r/min下離心l0min, 測沉淀物在發(fā)酵液中的比例即得菌絲濃度,42,pH8.0時,生長良好,產量稍有下降,但CA分解更快。,pH7.0時,細胞和CA都很高,但仍出現(xiàn)CA迅速分解。,CA,細胞,產物,細胞,,,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,43,控制pH7.0和8.0時,

26、最高細胞濃度接近相同(約16%PMV),但控制pH6.0時細胞生長受抑制。 在2.5升生物反應器內:不控制pH時,最高產率2.47μg/(m1·h );控制pH7.0時,最高產率3.37μg/(m1·h); 控制pH8.0時,最高產率2.02μg/(m1·h); 在控制pH6.0時,CA產生被抑制,但降解少。 因此對細胞生長和CA產生最好將pH控制于7.0,但在控制pH7.0時,仍出現(xiàn)

27、CA的迅速分解。,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,44,由于CA生產的最適pH和減少CA分解的pH各不相同,因此在分批發(fā)酵中應用pH變換策略來控制。,在發(fā)酵前期,在細胞生長和產生CA期間控制pH7.0,4d后,當CA產量達最高值時,變換pH為6.0,以減少CA分解。最高CA濃度可保持24h。由于改變pH,使CA分解速率明顯降低。,2024年3月23日星期六,長江大學生科院生物工程系,45,1、發(fā)酵過程中pH會不會發(fā)

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