大陸新發(fā)人獸共患腸道病毒-沙波（sav）病毒的鑒定分析

1、大陸新發(fā)人獸共患腸道病毒-沙波（SaV）病毒的鑒定分析,上 海 交 通 大 學(xué) 華 修 國(guó),豬SaV中國(guó)株的首次發(fā)現(xiàn),2008年2月上海某豬場(chǎng)豬群爆發(fā)以腹瀉為主要癥狀的疾病，其中仔豬尤為嚴(yán)重，并出現(xiàn)仔豬死亡。采取7份腹瀉仔豬糞便樣品，同時(shí)采取正常仔豬糞便樣品90份。,,排除黃痢等疾病。PCV、PRC、TGEV、PEDV檢測(cè)，結(jié)果陰性；RT-PCR檢測(cè)SaV RNA。腹瀉仔豬糞樣中檢測(cè)到SaV，健康仔豬糞樣SaV

2、陰性；測(cè)序、序列遺傳進(jìn)化分析；動(dòng)物（小型豬）回歸試驗(yàn)（糞便懸液經(jīng)過(guò)濾）。,序列進(jìn)化分析,,小型豬回歸實(shí)驗(yàn)表明： SaV可導(dǎo)致仔豬腹瀉。其他癥狀也與豬場(chǎng)仔豬癥狀相同；腹瀉糞便樣品中檢測(cè)到SaV病毒；說(shuō)明豬場(chǎng)中造成腹瀉、仔豬死亡的即為SaV病毒。,豬SaV中國(guó)株的全基因組測(cè)定與序列分析,根據(jù)GenBank上已提交的SaV全長(zhǎng)序列，CLUSTAL比對(duì)后選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，共15套簡(jiǎn)并引物；對(duì)5’和3’采用RACE方法擴(kuò)增。,

3、本分離株全長(zhǎng)7558nt，包括9 nt的5’ UTR和14 nt的 3’ UTR；同其他分離株一樣本分離株含有兩個(gè)開放式閱讀框（ORFs）；ORF1：10～6774nt共6765nt，其中VP1從5140-6774nt共1635nt；ORF2：6771 ～ 7286nt共516nt。 ORF2編碼區(qū)3’ 端變異較大。,結(jié)果,全基因組同源性比較,,基于VP1的系統(tǒng)進(jìn)化分析,,ORF2編碼區(qū)3’ 端分析,氨基酸序列比對(duì),核酸序列比對(duì)

4、,,,SaV中國(guó)株小型豬感染模型的建立,技術(shù)路線,實(shí)驗(yàn)結(jié)果--體溫,白細(xì)胞數(shù)目(WBC),,紅細(xì)胞數(shù)目(RBC),血小板數(shù)目(PLT),臨床觀察,SaV攻毒后第2天豬即出現(xiàn)腹瀉，直到第18天結(jié)束；,對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組,病毒檢測(cè)結(jié)果,盲腸內(nèi)容物中在攻毒第2天即檢測(cè)到病毒，一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束（第36天）。心臟，肝臟等組織和膽汁、血清中沒有檢測(cè)到病毒存在；,臨床病理變化,胃，對(duì)照組,胃，實(shí)驗(yàn)組,,小腸，對(duì)照組,小腸，實(shí)驗(yàn)組,掃描電鏡照片,胃內(nèi)壁

5、，對(duì)照組。,實(shí)驗(yàn)組，胃黏膜部分脫落,掃描電鏡照片,對(duì)照組小腸絨毛。腸絨毛呈指狀，表面規(guī)則,實(shí)驗(yàn)組。小腸絨毛嚴(yán)重萎縮，部分破潰。,,實(shí)驗(yàn)組，小腸絨毛呈長(zhǎng)指狀，表面規(guī)則光滑，有環(huán)狀溝槽。,實(shí)驗(yàn)組，小腸絨毛嚴(yán)重萎縮。,,對(duì)照組。小腸上皮細(xì)胞覆蓋一層致密均勻的微絨毛。,實(shí)驗(yàn)組，微絨毛中度不規(guī)則，中間有裂紋。,實(shí)驗(yàn)組。微絨毛呈嚴(yán)重不規(guī)則狀并脫落。,透射電鏡,對(duì)照組十二指腸上皮細(xì)胞×4000,實(shí)驗(yàn)組十二指腸上皮細(xì)胞×40

6、00細(xì)胞膜嚴(yán)重萎縮、破裂,結(jié)論,SaV攻毒后第2天豬即出現(xiàn)腹瀉，直到第18天結(jié)束；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在ALT、AST、ALKP等指標(biāo)上無(wú)明顯差異；攻毒后WBC、PLT在攻毒后急劇升高，隨后下降；紅細(xì)胞減少，體溫有緩慢升高。,,實(shí)驗(yàn)組豬剖檢腹部脹氣，胃和小腸充血；盲腸內(nèi)容物中在攻毒第2天即檢測(cè)到病毒，一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束（第36天）；血清、膽汁和各組織中均未檢測(cè)到病毒存在。,,掃描電鏡結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組胃有明顯病變，黏膜部分脫落 ；

7、實(shí)驗(yàn)組小腸絨毛脫落，有部分破潰，微絨毛不規(guī)則、脫落，中間有裂紋 ；投射電鏡結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組豬胃和十二指腸上皮細(xì)胞細(xì)胞器病變，細(xì)胞核部分破裂，線粒體空泡變。,華東地區(qū)豬群中SaV分子流行病學(xué)調(diào)查,2008年4-6月之間分別從上海、江蘇、安徽采取新鮮豬糞樣202、118、499份。RT-PCR檢測(cè)SaV病毒RNA。核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析。,檢測(cè)結(jié)果,序列進(jìn)化分析,,,本研究共從上海、江蘇、安徽等地豬糞便樣品中檢測(cè)到SaV42株，分離

8、到5個(gè)核苷酸不完全相同的序列，序列間同源性為85.1-99.0%。一月齡一下的仔豬感染率最高，達(dá)7.2%。進(jìn)化分析顯示這5株毒株中4株聚為一支，與荷蘭分離株同源性較高；另一株與美國(guó)和巴西分離株聚為一支。,總結(jié),首次在中國(guó)腹瀉豬群中發(fā)現(xiàn)SaV病毒；完成了SaV病毒的全基因組序列測(cè)定及分析（JV)；系統(tǒng)地建立中國(guó)株巴馬小型豬SaV感染模型；初步調(diào)查了華東地區(qū)豬群中的SaV流行情況。,沙波病毒（Sapovirus， SaV）最早從日本

9、Sapporo地區(qū)一個(gè)嬰兒之家爆發(fā)腹瀉事件中發(fā)現(xiàn)的病毒，故又稱札幌樣病毒，現(xiàn)被歸屬為為杯狀病毒科(Caliciviridae)。,非標(biāo)記免疫電鏡照片,關(guān)于沙波病毒,已成為人畜急性腸胃炎主要病毒性感染源之一；以糞-口途徑傳播為主，是食源性人畜共患病；在人口密集場(chǎng)所（如學(xué)校）容易暴發(fā)群體感染；病毒能常態(tài)持續(xù)存在于自然環(huán)境中， 能在水體和 食物中長(zhǎng)時(shí)間的存在。能在水質(zhì)和貝類消化道中檢測(cè)到。,流行規(guī)律,流行區(qū)域,美、英、日、韓等國(guó)已

10、有人感染SaV報(bào)道；日，美，韓，巴西等國(guó)已有豬SaV感染報(bào)道。其中巴西豬群SaV的感染率為高達(dá)30%。中國(guó)之前還未見報(bào)道。,主要臨床癥狀：,人：患者以惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等為主要癥狀；并伴有免疫力降低，容易并發(fā)或繼發(fā)其他疾??； 豬：豬以嚴(yán)重腹瀉等消化道癥狀為主，患病仔豬死亡率可達(dá)30％。病豬飼料轉(zhuǎn)化率降低、生長(zhǎng)緩慢。,,基因分型,基因組結(jié)構(gòu),單股正鏈RAN病毒，基因組全長(zhǎng)約7.5Kb。G I、 G IV和GV 型含有3