tgfβ1誘導(dǎo)肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化

1、TGFβ1誘導(dǎo)肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化作者：黃振杰鄭金旭莫凱天蘇石芳作者單位：廣西北海市人民醫(yī)院呼吸科江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科上海市第八人民醫(yī)院消化科【摘要】目的：通過觀察TGF1誘導(dǎo)下A549細胞出現(xiàn)的細胞形態(tài)學(xué)和Ecad表達的變化，探討上皮細胞間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymaltransitionEMT)過程在肺纖維化發(fā)病機制中的作用。方法：體外培養(yǎng)A549細胞，以TGF1進行干預(yù)，收集不同時段的細胞，應(yīng)用熒光實時定

2、量PCR(RTPCR)檢測TGF1干預(yù)前后Ecad的mRNA表達變化倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)的變化間接免疫熒光觀察Ecad蛋白表達的變化。結(jié)果：倒置相差顯微鏡觀察到TGF1干預(yù)后A549細胞由鵝卵石狀變?yōu)樗笮?，形態(tài)如同肌纖維母細胞。間接免疫熒光顯示A549細胞的Ecad表達(紅色熒光染色)隨時間延長逐漸減少。RTPCR顯示Ecad的mRNA表達下調(diào)(P0.05)。結(jié)論：TGF1在體外誘導(dǎo)肺泡上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化

3、是肺纖維化的重要發(fā)病機制之一?！娟P(guān)鍵詞】轉(zhuǎn)化生長因子1A549細胞上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化肺纖維化Abstract：ObjectiveByobservingthecellularmphologychangestheexpressionofEcadafterA549cellsweretreatedwithtransfminggrowthfact1(TGF1)，toinvestigatetheroleofepithelialmesenchymalt

4、ransition(EMT)inthepathogenesyofpulmonaryfibrosis.MethodA549cellsculturedinvitroweretreatedbyTGF1thenharvestedatdifferenttimepointstoassaymRNAexpressionofEcadbyrealtimePCR(RTPCR)befeafterA549cellsbeingtreatedbyTGF1.Cellu

5、larmphologychangeswereobservedbyphasecontrastmicroscope.ProteinexpressionofEcadbyindirectimmunofluescence.ResultsAfterbeingtreatedbyTGF1，A549cellswereobservedbyinvertedphasecontrastmicroscopetoturnfrompebbleshapetofusifm

6、shape，amyofibroblastlikemphology.IndirectimmunofluescenceshowedproteinexpressionofEcadreducedastimewentby(redstain).ThemRNAexpressionofEcadwasdownregulatedinRTPCR(P0.05).ConclusionTGF1inducedEMTofalveolarepithelialcellsi

7、nvitrosuggeststhatEMTofalveolarepithelialcellsmightbeoneoffundamentalmechanismsofpulmonaryfibrosis.KeyWds:TransfminggrowthfactA549cellsEpithelialmesenchymaltransitionPulmonaryfibrosis特發(fā)性肺纖維化(IPF)是最常見的肺間質(zhì)疾病也是肺間質(zhì)纖維化的主要原因。多

8、數(shù)肺間質(zhì)疾病病因不明其發(fā)病機制目前也未完全闡明。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為各種損傷因素?fù)p傷肺泡上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞，炎癥細胞浸潤，細胞因子失衡，肺實質(zhì)損傷后繼發(fā)肺間質(zhì)細胞增殖過度修復(fù)導(dǎo)致纖維化。國外有文獻報道IPF是一種涉及異常創(chuàng)傷愈合的功能紊亂，進行性的上皮損傷和(或)激活可能處于纖維形成和間質(zhì)細胞增殖的核心位置，這種作用是不依賴于炎癥的[12]。肺泡上皮細胞(AECs)不僅僅是作為發(fā)病的促動因素，它們本身就可以通過一個叫做上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(

9、epithelialmesenchymaltransition，EMT)的過程獲得間質(zhì)細胞表型而作為成纖維細胞和肌纖維母細胞的重要來源。在這個新的模式中，肺泡上皮應(yīng)該被看作纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，它作為一個多能的干細胞具有相當(dāng)?shù)目伤苄?，能參與到交替的途徑中：上皮再生修復(fù)正常的肺泡結(jié)構(gòu)，凋亡，或者通過EMT形成纖維化。本研究通過用TGF1誘導(dǎo)A549從肺泡上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，進一步探討肺泡上皮細胞在肺纖維化發(fā)病中的作用為闡明肺纖維化發(fā)病

10、的分子生物學(xué)機制及尋求新的治療方法提供TGF1組相比，A549細胞在加入TGF1后其上皮細胞標(biāo)志物Ecad的mRNA表達在24小時內(nèi)總體呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，在第24h時間點上最明顯(P0.01)，在第3h時間點上出現(xiàn)一個短暫反彈(P0.05)。3討論EMT是一種完全分化的上皮細胞經(jīng)歷細胞表型改變轉(zhuǎn)化成完全分化的間質(zhì)細胞的過程，通常轉(zhuǎn)化成成纖維細胞和肌纖維母細胞[3]。EMT過程很久以來一直被認(rèn)為在胚胎發(fā)育和惡性腫瘤的細胞轉(zhuǎn)分化中起主導(dǎo)作用。外

11、胚層在早期形成原間質(zhì)的發(fā)育中經(jīng)歷了EMT過程。次級上皮通過間質(zhì)細胞上皮轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。這些次級上皮然后分化形成完全成熟的上皮，或者經(jīng)歷第二輪EMT形成各種各樣的間質(zhì)細胞和結(jié)締組織細胞，例如脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、肌細胞和成纖維細胞[4]。近年來發(fā)現(xiàn)EMT可以發(fā)生于多種生理、病理過程，不僅在胚胎發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)的早期階段起重要作用，還促進傷口愈合和多種器官的纖維化。正常狀態(tài)下上皮細胞通過細胞間黏附機制緊密連接在一起，E鈣黏蛋白(Ec

12、adherin)是組成上皮細胞間緊密連接的重要成分，在保持細胞完整性和極性中起重要作用。TGF1誘導(dǎo)的EMT早期變化就是E鈣黏蛋白表達受到抑制，也就是細胞間緊密連接的破壞上皮細胞喪失黏附特性，逐漸從基底膜上脫落然后胞質(zhì)內(nèi)細胞骨架進行重排表達新的表型蛋白如平滑肌肌動蛋白(SMA)胞質(zhì)內(nèi)肌絲也從上皮型的角蛋白(cytokeratin)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細胞的波形蛋白(vimentin)[5]。細胞形態(tài)由鵝卵石狀變成梭形，類似成纖維細胞或者肌纖維母細

13、胞，電鏡下可見細胞極性發(fā)生改變，微絨毛消失，細胞內(nèi)出現(xiàn)密體，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量肌動蛋白微絲。如果細胞在過渡階段，兩類細胞標(biāo)志可同時表達。這些變化可能為細胞遷徙、收縮能力增強提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。本研究中，A549細胞在5ngmlTGF1的誘導(dǎo)下，上皮細胞標(biāo)志物Ecad的mRNA表達在24h內(nèi)總體呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，在第24小時時間點上最明顯間接免疫熒光也顯示Ecad蛋白隨時間延長表達減少這說明TGF1可以直接誘導(dǎo)肺EMT的發(fā)生，而且這種作用還存在時間

14、依賴性。Ecad在第3小時時間點上出現(xiàn)一個短暫反彈推測可能與TGF1促進A549細胞自分泌TGF1到達一定水平產(chǎn)生的負(fù)反饋作用有關(guān)。在很多器官包括肺的纖維化的誘導(dǎo)中，TGF1作為總開關(guān)被連接在一起[6]。單是TGF1在幼鼠和成年鼠肺中的定向表達就可以在微乎其微的炎癥下誘導(dǎo)出顯著的纖維變性反應(yīng)[7]，而且如前所討論，TGF1激活障礙可以提供明顯的保護作用，阻止博萊霉素在轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)的纖維化[8]。這一切似乎提示了，正是因為TGF1在E

15、MT的誘導(dǎo)中起到主導(dǎo)作用，它具有極強的促進上皮細胞表型喪失的能力，因此在肺纖維化的發(fā)生中起了關(guān)鍵作用。目前，大量涉及EMT的研究主要集中在癌轉(zhuǎn)移及腎纖維化上。EMT在腎纖維化形成中起到突出的作用，在這一過程中，上皮細胞失去了細胞細胞附件、極性和上皮細胞的特異性標(biāo)記，經(jīng)歷了細胞支架的重塑，而獲得間質(zhì)細胞的表型。本研究用TGF1誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生了EMT，說明肺泡上皮細胞在體外確實可以發(fā)生EMT。但究竟是Ⅰ型肺泡上皮細胞(AT1)還是Ⅱ型

16、肺泡上皮細胞(AT2)，或者AT1和AT2兩種肺泡上皮細胞都經(jīng)歷了EMT仍不確定?？赡芴囟ǔ潭鹊膿p傷使AT1細胞更有可能經(jīng)歷凋亡而AT2細胞優(yōu)先選擇了EMT。在體外實驗中，AT2細胞逐漸表達并獲得的所有AT1的表型標(biāo)志，這表明了AT2細胞在體外朝AT1細胞表型(類AT1細胞)轉(zhuǎn)分化[910]。目前的實驗條件可以做到將已經(jīng)獲得AT1細胞特征的細胞再次誘導(dǎo)恢復(fù)到AT2細胞表型[10]，說明了分化的AEC表型表現(xiàn)出來的可塑性遠比之前想象的要大