SUMO修飾蛋白在分枝桿菌感染中的動(dòng)態(tài)變化及抗海分枝桿菌天然化合物的初篩.pdf

1、目的：
　?。?）研究小泛素樣修飾物（SUMO）修飾蛋白在分枝桿菌感染金魚(yú)動(dòng)物模型中的動(dòng)態(tài)變化，探討 SUMO修飾與分枝桿菌致病的關(guān)系。
　?。?）在26種天然單體化合物中篩選出具有抗海分枝桿菌的天然單體化合物。
　　方法：
　?。?）金魚(yú)90條，隨機(jī)分為WT野生組30條，分枝桿菌細(xì)胞壁脂質(zhì)結(jié)核菌醇二分枝菌酸（PDIM）突變組（FAD）30條，PBS對(duì)照組30條，將濃度為10^8 cfu/mL的菌懸液于金魚(yú)泄殖腔

2、附近進(jìn)行腹腔注射，每條魚(yú)注射100μL，建立海分枝桿菌感染金魚(yú)模型，對(duì)照組金魚(yú)注射等量的無(wú)菌PBS溶液。通過(guò)HE、抗酸染色驗(yàn)證該動(dòng)物模型，觀察組織肉芽腫的形態(tài)。采用免疫組織化學(xué)染色對(duì)IL-6的表達(dá)進(jìn)行定位和相對(duì)定量，應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)IL-6、SUMO-1、UBC-9蛋白的表達(dá)。通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TNF-α、IL-12、SUMO-1、UBC-9、SENP-1 mRNA表達(dá)水平變化。
　　（2）采用倍比稀釋法

3、進(jìn)行海分枝桿菌體外藥物敏感試驗(yàn)，測(cè)定天然單體單獨(dú)使用和與利福平聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)海分枝桿菌的最低抑菌濃度（MIC），并根據(jù)公式計(jì)算出部分抑菌濃度（FIC）值，判斷是否與利福平有協(xié)同作用。
　　結(jié)果：
　?。?）成功建立海分枝桿菌感染金魚(yú)模型。
　　（2）HE染色及抗酸染色結(jié)果顯示，金魚(yú)感染海分枝桿菌后有典型的類(lèi)結(jié)核肉芽腫形成。鏡下見(jiàn)肉芽腫組織內(nèi)有大量海分枝桿菌存在。PBS對(duì)照組金魚(yú)均無(wú)肉芽腫結(jié)構(gòu)形成，也未見(jiàn)海分枝桿菌存在。<

4、br>　?。?）免疫組織化學(xué)染色與Western Blot結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組比較，金魚(yú)在感染海分枝桿菌（WT和FAD組）后細(xì)胞因子IL-6表達(dá)增加，其中，WT組比FAD組增加更顯著。蛋白SUMO-1與UBC-9表達(dá)均有所升高，WT組比FAD組表達(dá)升高明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。?）RT-PCR結(jié)果顯示，與 PBS對(duì)照組比較，WT組與FAD組的TNF-α、IL-12 mRNA表達(dá)增加，且WT組表達(dá)增加更明顯。SUMO-1

5、、UBC-9 mRNA表達(dá)水平均升高，WT組升高更顯著。與PBS對(duì)照組比較，WT組與FAD組SENP-1 mRNA表達(dá)水平均降低，WT組表達(dá)降低更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　（5）單獨(dú)體外藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果顯示：8種天然單體JM271、SDXQ2、SDXQ9、J43233、J22-1、Compound-1、SDX28、G565有一定抗海分枝桿菌活性。聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果顯示，4種天然單體化合物SDX28、G565、H208、ZXQ

6、4p-1與利福平有不同程度的協(xié)同作用。
　　結(jié)論：
　?。?）分枝桿菌感染金魚(yú)后，可能通過(guò)其細(xì)胞壁脂質(zhì)成分 PDIM/PGL調(diào)控SUMO修飾通路，介導(dǎo)炎性介質(zhì)（如TNF-α、IL-6及IL-12等）表達(dá)上調(diào)，從而形成炎性肉芽腫，導(dǎo)致病變。
　?。?）本實(shí)驗(yàn)初步篩選出了8種（JM271、SDXQ2、SDXQ9、J43233、J22-1、Compound-1、SDX28、G565）具有抗海分枝桿菌的天然單體化合物，且發(fā)現(xiàn)其