細葉百合鱗莖休眠解除過程的生物學分析.pdf

1、百合是世界各國人們都喜愛的球根花卉，鱗莖秋季收獲后便進入自然休眠的狀態(tài)。需要經(jīng)過一段時期的低溫處理才會徹底解除休眠保證第二年正常開花生長。鱗莖休眠的解除是一個復雜的生物過程。激素、碳水化合物與內(nèi)外環(huán)境因子及遺傳基因等構成復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)調(diào)控著休眠的整個過程。百合鱗莖休眠的研究目前主要集中在低溫解除休眠過程中的形態(tài)變化和生理生化變化方面，而分子水平的研究甚少。本研究以細葉百合（Lilium pumilum）為試材，5℃低溫解除休眠過程中，在

2、對百合鱗莖休眠的細胞學及生理學研究的基礎上，利用分子生物學技術，構建了百合鱗莖休眠解除過程中的抑制差減cDNA文庫，獲得大量與休眠調(diào)控相關的基因，并利用雙向電泳技術手段來研究和分析細葉百合鱗莖通過低溫解除休眠過程中差異表達的蛋白質(zhì)及其調(diào)控功能，以期為進一步研究鱗莖休眠機制奠定基礎。主要研究結果如下：
　　1、通過石蠟切片和實體顯微結構觀察，低溫冷藏期間，細葉百合花芽分化主要分為小花原基分化期，外輪花被原基分化期，內(nèi)輪花被原基分化期

3、，雄蕊和雌蕊原基分化期四個時期。鱗片及頂芽細胞內(nèi)淀粉粒數(shù)量逐漸減少。冷藏36 d以后細胞分裂數(shù)量逐漸增加。透射電鏡觀察表明，低溫處理0～12 d，鱗莖物質(zhì)和能量代謝較弱，鱗莖不能萌發(fā);12～48 d鱗莖萌發(fā)率較低，線粒體及高爾基體分泌囊泡增多，細胞通過質(zhì)膜內(nèi)吞及胞間連絲進行物質(zhì)交流;48～72 d，核仁松散，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有序排列，在液泡膜與質(zhì)膜邊緣形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)橋，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)橋一直延伸到核膜方向，胞內(nèi)及胞間聯(lián)系已經(jīng)建立，鱗莖出現(xiàn)新生根;冷藏84 d時

4、頂芽已伸長到鱗莖頂端。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)橋延伸到胞間連絲，細胞器內(nèi)部結構及數(shù)量增加，休眠完全打破。冷藏過程中百合鱗莖的頂芽隨冷藏時間的推移漸漸伸長，呼吸速率呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。冷藏時間越長，鱗莖萌發(fā)時間越短。
　　2、在細葉百合鱗莖低溫貯藏過程中，項芽與鱗莖盤中的核酸含量發(fā)生了明顯的變化，項芽分生組織中DNA、RNA含量及RNA/DNA的比值在鱗莖冷藏36 d時變化最為明顯，貯藏36 d是內(nèi)外鱗片DNA及核酸總含量的轉(zhuǎn)折點。頂芽和鱗莖盤冷

5、藏0～36 d內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的含量升高，鱗莖不同部位可溶性蛋白質(zhì)含量在冷藏48 d后迅速降低也是鱗莖開始解除休眠的重要體現(xiàn)。鱗莖休眠解除過程中伴隨著旺盛的糖類代謝活動，淀粉含量下降，淀粉酶活性升高。貯藏前期，蔗糖含量，蔗糖代謝關鍵酶SS和SPS活性上升，SPS和SS協(xié)同控制蔗糖代謝及轉(zhuǎn)運。冷藏條件下鱗片及項芽內(nèi)淀粉向可溶性糖方向代謝過程中促進了AGPase活性的增加。AGPase可能是休眠打破的一個重要的生理決定因素。鱗片、頂芽及鱗莖盤

6、SOD、POD、CAT活性在冷藏前期下降，冷藏中后期，SOD、CAT、ASP活性升高，鱗片中POD的活性下降，項芽及鱗莖盤POD、PPO在冷藏中期上升。各種代謝相關酶在不同器官中的作用并不完全相同。36 d是鱗莖解除休眠的起點，60 d時鱗莖基本解除休眠。
　　3、利用抑制消減雜交技術構建了細葉百合鱗莖休眠及解除正、反向抑制消減文庫。對正、反向文庫隨機挑選陽性克隆測序各獲得100個表達序列標簽(EST)，在NCBI上進行BLAST

7、x分析并用KOBAS系統(tǒng)將獲得的unigene定位到Pathways中。分析結果表明，差異基因GO功能主要富集在蛋白質(zhì)合成、細胞抗性及防御過程、信號轉(zhuǎn)導、結合活性、轉(zhuǎn)錄活性、代謝過程等。休眠文庫ESTs功能主要涉及脅迫響應方面，苯丙素生物合成及苯丙氨酸代謝途徑，促分裂素原活化蛋白激酶/MAPK激酶及抗壞血酸代謝途徑等與休眠有關。休眠解除文庫在糖代謝、激素響應及信號轉(zhuǎn)導方面表達量較高，淀粉及蔗糖代謝途徑、α-亞麻酸代謝、亞油酸代謝途徑、甲

8、硫氨酸和半胱氨酸等氨基酸代謝途徑、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)等參與了休眠解除過程。選取了8個差異表達基因用Real-time PCR檢測分析，這些基因在百合鱗莖休眠解除過程中大部分上調(diào)表達。
　　4、利用熒光差異凝膠電泳分離得到31個差異表達蛋白點。相對于休眠鱗莖，休眠解除鱗莖中上調(diào)表達的蛋白點有14個，占總數(shù)的45.16％;下調(diào)表達的蛋白點有17個，占總數(shù)的54.84％;應用MS質(zhì)譜成功鑒定12個差異蛋白點，按功能劃分為6類，分析表明，