Wnt5a介導脫細胞干細胞基質抑制軟骨細胞肥大化的分子機制研究.pdf

1、研究目的:探究脫細胞干細胞基質(DSCM)促進滑膜間充質干細胞(SMSCs)成半月板軟骨分化及抑制軟骨細胞肥大化的分子機制，明確信號通路中關鍵作用分子，構建體外促進SMSCs成軟骨分化及抑制軟骨細胞分化體系，為解決SMSCs在半月板軟骨組織工程中遇到的問題及臨床上半月板鈣化找到有效的方案。
　　研究方法:將SMSCs于傳統培養(yǎng)瓶(Plastic)成軟骨誘導分化2周后，去除培養(yǎng)基中轉化生長因子-β(TGF-β)，降低地塞米松濃度，加

2、入甲狀腺激素進行軟骨細胞肥大化誘導培養(yǎng)，探究軟骨細胞肥大化對半月板修復的影響;將SMSCs分別置于傳統培Plastic和DSCM擴增培養(yǎng)后，置于Pellet系統中成軟骨誘導分化，檢測Sox9、Col1a1、Col2a1、aggrecan、GAG等纖維軟骨相關標志物及ALP、MMP-13、Col10a1等細胞肥大化相關標志物，探究DSCM抑制軟骨細胞肥大化作用;將經DSCM擴增培養(yǎng)的SMSCs置于Pellet系統中成軟骨細胞誘導分化培養(yǎng)，

3、檢測Wnt5a的表達量;成軟骨培養(yǎng)中分別依次加入Wnt5a受體抑制劑UM206、Erk磷酸化抑制PD98059、p38MAPK抑制劑SB203580檢測軟骨相關和肥大化相關標志物，探究Wnt5a等信號通路介導DSCM促進SMSCs成軟骨分化、抑制軟骨細胞肥大性分化的分子機制;體外條件下，于傳統成軟骨誘導培養(yǎng)基中加入Wnt5a激動劑，探究Wnt5a是否作為DSCM促進SMSCs成軟骨分化、抑制軟骨細胞肥大性分化的關鍵因子。
　　研究

4、結果:SMSCs具有很強的貼壁生長能力，成脂、成骨、成軟骨誘導檢測陽性。與成軟骨誘導培養(yǎng)比較，SMSCs在甲狀腺激素刺激肥大化誘導培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)后，其細胞形態(tài)出現明顯的肥大化表型。誘導分化28天后，軟骨小球中軟骨細胞仍然表現肥大化狀態(tài)。對軟骨小球中的Ⅰ型膠原(COLⅠ)進行免疫組化染色，結果顯示經過成軟骨培養(yǎng)基誘導形成的軟骨小球，其染色強度較經肥大化培養(yǎng)基誘導分化成的軟骨小球強。Ⅹ型膠原(COLⅩ)在經過成軟骨培養(yǎng)基誘導的軟骨小球中染

5、色幾乎呈現陰性，但在肥大化培養(yǎng)基誘導分化的軟骨小球中其染色呈現強陽性。PCR結果顯示肥大化誘導促進肥大化相關基因表達。將SMSCs分別置于含有和不含有DSCM的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，不含DSCM培養(yǎng)瓶中的SMSCs表現出肥大化細胞形態(tài)，而置于DSCM中擴增培養(yǎng)的SMSCs保持其干性形態(tài)。將經“Plastic”擴增培養(yǎng)的SMSCs分別轉入“DSCM”和“Plastic”中擴增培養(yǎng)，被轉入到“DSCM”中擴增培養(yǎng)的SMSCs密度增高，而轉入到“Pl

6、astic”中擴增培養(yǎng)的SMSCs密度沒有明顯變化;將經“DSCM”擴增培養(yǎng)的SMSCs分別轉入到“Plastic”和“DSCM”中擴增培養(yǎng)，被轉入到“DSCM”中擴增培養(yǎng)的SMSCs密度沒有明顯的變化，而轉入到“Plastic”中擴增培養(yǎng)的SMSCs密度卻明顯的降低。DSCM可以顯著增加SMSCs增殖能力及成軟骨指數，即增加GAG/DNA比值。與在Plastic中成軟骨分化細胞，SMSCs在DSCM中擴增培養(yǎng)后形成的軟骨小球體積顯著增

7、加，同時COLⅠ的表達量也顯著的增加。RT-PCR對成軟骨分化過程中Col1a1分子進行檢測，結果顯示，與Plastic相比，DSCM可以顯著的增加ColⅠa1的表達。將SMSCs置于DSCM中成軟骨誘導培養(yǎng)，結果顯示，誘導產生的軟骨小球Pellet體積變大、GAG及COLⅡ合成量增加，肥大化標志基因ColⅩ、ALP及MMP-13表達被抑制。SMSCs分別置于傳統培養(yǎng)瓶Plastic和DSCM中擴增培養(yǎng)8天，然后置于Pellet系統中進

8、行成軟骨誘導分化35天。分別采用RT-PCR和West blot對SMSCs成軟骨分化階段Wnt5a表達量進行檢測，結果顯示，在SMSCs增殖培養(yǎng)階段，DSCM中Wnt5a表達量約是Plastic中Wnt5a表達量的5倍，而于成軟骨誘導分化階段，DSCM中Wnt5a表達量約是Plastic中Wnt5a表達量的5倍。SMSCs分別置于含有Wnt5a和不含有Wnt5a的傳統培養(yǎng)瓶中擴增培養(yǎng)8天，同樣的，經Wnt5a擴增培養(yǎng)的SMSCs成軟骨

9、分化能力較強。Wnt5a能夠明顯的促進纖維軟骨基因表達，同時能夠抑制ALP、MMP-13、Runx2、Col10a1等肥大化相關基因的表達。SMSCs分別置于含有PD98059和不含有PD98059的傳統培養(yǎng)瓶Plastic中及含有PD98059和不含有PD98059的DSCM中擴增培養(yǎng)8天，結果顯示，SMSCs于含有PD98059的培養(yǎng)基中擴增時，其增殖能力較對照組顯著減弱。SMSCs分別置于含有SB203580和不含有SB20358

10、0的傳統培養(yǎng)瓶Plastic中及含有SB203580和不含有SB203580的DSCM中擴增培養(yǎng)后成軟骨誘導分化。結果顯示，SMSCs于含有SB203580的培養(yǎng)基中擴增時，其成軟骨分化能力較對照組顯著減弱。
　　研究結論:體外條件下，SMSCs誘導分化成的軟骨細胞具有肥大化現象，使生的半月板版軟骨出現鈣化。DSCM可以促進SMSCs成軟骨分化，抑制肥大性分化。DSCM中Wnt5a作為關鍵作用分子，具有促進SMSCs成軟骨分化、抑