口腔鱗癌中NKD1、NKD2基因mRNA表達及甲基化的研究.pdf

1、目的：口腔鱗狀細胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC）是口腔頜面部最常見惡性腫瘤之一，占全球惡性腫瘤的3％。據統(tǒng)計，我國每年口腔癌的新發(fā)病例約4.65萬，發(fā)病年齡大多在40-60歲之間，男性相對女性較多。隨著醫(yī)療水平的逐漸提高，以手術切除為主的綜合序列治療方法使口腔癌的預后有了明顯改善，但患者的5年生存率仍停留在55%-60%。眾所周知，OSCC的預后取決于臨床分期，組織學分級，淋巴結轉移等因素，但大

2、多數患者就診時已屬晚期，因此口腔癌的早期診斷，早期治療十分重要。研究者報道除基因變異、缺失等遺傳因素外，DNA甲基化等表觀遺傳學的改變是腫瘤的發(fā)生的早期事件。臨床應用表觀遺傳學標志物能夠對口腔鱗癌做到早期診斷,對預后準確預測，進而改善患者的生存質量，提高患者的生存率。人源NKD基因家族包括NKD1（Naked cuticle homolog1）和NKD2（Naked cuticle homolog2）基因，NKDl、NKD2基因分別定位

3、于染色體16q12.1及5p15.3上，研究發(fā)現NKD1、NKD2基因相關定位位點在肝癌、胃癌、乳腺癌等多種癌癥中頻繁的出現雜合性缺失（Loss of heterozygosity，LOH），包括乳腺癌、骨肉瘤在內的多種惡性腫瘤中均存在NKD1、NKD2基因mRNA表達水平異常及甲基化狀態(tài)的改變。但是在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中，NKD1、NKD2基因的表達及甲基化狀態(tài)尚無文獻報道。因此本實驗通過采用RT-PCR和MSP方法檢測NKD1、NK

4、D2基因的表達水平及甲基化狀態(tài)，并分析其與OSCC各項臨床病理特征之間的相關性，探討NKD1、NKD2基因在OSCC的發(fā)生發(fā)展中的作用，為口腔鱗癌的早期診斷，早期治療提供理論依據。
　　方法：
　　1.標本均來源于2015年9月至2016年11月期間河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院口腔科手術治療的52例OSCC患者，以術中切除的OSCC組織作為實驗組，以相對應癌旁2cm正常黏膜組織為對照組，實驗組及對照組組織學診斷均經術后病理驗證，標本

5、于-80℃生物標本庫中凍存。
　　2.采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR,Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)檢測52例OSCC及相對應正常組織內NKD1、NKD2基因mRNA表達量。
　　3.應用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP,Methylation Specific Polymerase Chain Reaction)檢測52例OSCC及相對應正常組織內NK

6、D1、NKD2基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。
　　4.應用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，基因mRNA表達差異比較應用配對t檢驗，成組t或近似t檢驗；兩基因mRNA表達相關性應用直線相關分析；基因甲基化的比較應用Fisher確切概率法或四格表χ2檢驗；兩基因間甲基化相關性應用Spearman等級秩和相關分析。當P<0.05證明差異存在統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.NKD1基因mRNA相對表達量在OSCC組織中

7、為0.50±0.12，低于其對應正?？谇火つそM織0.66±0.18，二者差別有統(tǒng)計學意義(t=19.934, P＜0.001)。臨床Ⅰ期+Ⅱ期OSCC組織中NKD1基因mRNA相對表達量是0.53±0.12，高于臨床Ⅲ期+Ⅳ期0.44±0.10(t=-3.041,P=0.004);有淋巴結轉移組NKD1 mRNA的相對表達量0.44±0.10，低于無淋巴結轉移組0.52±0.12(t=2.469,P=0.017)；NKD1基因mRNA的

8、相對表達量與年齡、性別和吸煙與否無相關性(P>0.05)。
　　2.NKD2基因mRNA的相對表達量在OSCC組織中為0.42±0.10，低于其對應正?？谇火つ?.62±0.12，二者差異有統(tǒng)計學意義(t=10.915,P＜0.001)。臨床Ⅰ期+Ⅱ期OSCC組織中NKD2基因mRNA相對表達量為0.44±0.10，高于臨床Ⅲ期+Ⅳ期中0.37±0.05(t=-3.739,P＜0.001);有淋巴結轉移組0.37±0.07低于無淋

9、巴結轉移組0.45±0.10(t=2.873,P=0.006)；吸煙組0.38±0.09低于不吸煙組0.45±0.08(t=-3.395,P=0.001)；NKD2基因mRNA的相對表達量與性別及年齡無相關性(P>0.05)。
　　3.NKD1基因甲基化陽性表達率在OSCC組織中48.08%(25/52)高于相對應正?？谇火つそM織26.92%(14/52)，二者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.964,P=0.026)。臨床Ⅰ期+Ⅱ期O

10、SCC組織中NKD1基因甲基化率為35.48%(11/31)，低于Ⅲ期+Ⅳ期66.67(14/21)(χ2=4.877,P=0.027);NKD1甲基化率在有淋巴結轉移組中70.59%(12/17)高于無淋巴結轉移組37.14%(13/35)(χ2=5.127,P=0.024)；NKD1基因甲基化率與年齡、性別及吸煙無關(P>0.05)。
　　4.NKD2基因甲基化陽性表達率在OSCC中44.23%(23/52)高于相應的正?？谇?/p>

11、黏膜組織21.15%(11/52)，兩者差別有統(tǒng)計學意義(χ2=6.292,P=0.012)。臨床Ⅰ期+Ⅱ期OSCC組織中NKD2基因甲基化率為29.03%(9/31)，低于Ⅲ期+Ⅳ期66.67%(14/21)(χ2=7.188,P=0.007)；有淋巴結轉移組64.71%(11/17)高于無淋巴結轉移組34.29%(12/35)(χ2=4.293,P=0.038)；吸煙組57.14%(16/28)高于不吸煙組29.17%(7/24)(

12、χ2=4.1,P=0.043)。NKD2甲基化陽性表達率與性別和年齡無關(P>0.05)。
　　5.在OSCC中，NKD1甲基化組mRNA相對表達量0.44±0.11低于非甲基化組mRNA表達量0.54±0.11(t=-3.344，P=0.002)。NKD2基因甲基化組mRNA相對表達量0.36±0.06低于非甲基化組mRNA的相對量0.47±0.09(t=-4.934，P＜0.001)。
　　6在OSCC中，NKD1、NK

13、D2兩基因均發(fā)生甲基化者共16例，均未發(fā)生甲基化者共20例，兩基因甲基化狀態(tài)在OSCC組織中呈正相關關系（r=0.038， P=0.005）；NKD1、NKD2兩基因mRNA相對表達量在OSCC組織中呈正相關關系（r=0.312,P=0.024）。
　　結論：
　　1.NKD1、NKD2基因mRNA相對表達下降或沉默可能參與OSCC的發(fā)生與發(fā)展。其中，NKD1基因異常表達與臨床分期及淋巴結轉移相關。NKD2基因異常表達與臨床