E3泛素化連接酶CHIP在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究.pdf

1、目的:本研究試圖闡明E3泛素化連接酶CHIP在胃癌細胞株AGS細胞中的作用以及探討其潛在的生物學機制。
　　方法:應用qRT-PCR、Western blot以及IHC等方法檢測胃癌組織中CHIP的表達情況。采用慢病毒感染宿主細胞的方法轉染MSCV-GFP-hCHIP質粒并建立穩(wěn)定高表達CHIP的胃癌細胞株AGS-hCHIP。通過xCELLigence系統(tǒng)實時動態(tài)觀察CHIP高表達后細胞生長、細胞遷移以及細胞侵襲能力的變化。應用流

2、式細胞術檢測CHIP高表達后細胞周期的變化。采用Ki-67染色法以及TUNEL法檢測CHIP高表達后細胞增殖以及細胞凋亡的變化。通過細胞劃痕實驗觀察CHIP高表達后細胞遷移能力的變化。采用明膠酶譜MMP活性檢測方法檢測CHIP高表達后細胞內金屬蛋白酶活性的變化。應用qRT-PCR及Western blot技術檢測相關基因在mRNA水平以及蛋白水平的表達。通過Western blot技術檢測CHIP高表達后對細胞內AKT信號通路相關蛋白以

3、及TRAF-NF-κB信號通路相關家族成員蛋白水平的表達。
　　結果:胃癌組織中CHIP在mRNA水平以及蛋白質水平的表達均較正常組織呈相對低表達，且CHIP的表達量與胃癌的分化程度及TNM分期有顯著統(tǒng)計學差異（P<0.05）。在胃癌細胞株AGS中分別穩(wěn)定轉染MSCV-GFP-hCHIP質粒和MSCV-GFP質粒，成功獲得實驗組穩(wěn)定高表達CHIP的AGS-hCHIP細胞和對照組AGS-control細胞。AGS-hCHIP細胞的生

4、長速度明顯慢于AGS-control細胞，并且遷移、侵襲能力均較AGS-control細胞顯著減弱。AGS-hCHIP細胞與AGS-control細胞在細胞周期上無明顯差異。AGS-hCHIP細胞的增殖能力較AGS-control細胞顯著減弱。AGS-hCHIP細胞的凋亡細胞百分比較AGS-control細胞明顯增多。AGS-hCHIP細胞中ITGB1基因在mRNA和蛋白質水平的表達均較AGS-control細胞顯著下調。AGS-hCH

5、IP細胞中的MMP-2、MMP-9蛋白質水平的表達均較AGS-control細胞顯著下調，同時明膠酶譜MMP活性檢測方法檢測顯示AGS-hCHIP細胞中MMP-2和MMP-9的表達顯著低于AGS-control細胞。AGS-hCHIP細胞中Bcl-2基因在mRNA和蛋白質水平的表達均較AGS-control細胞明顯下調，其余相關基因Bcl-xl、cIAP1、Bax、A20、Bim、Mcl-1在mRNA水平的表達無明顯變化。AGS-hCH

6、IP細胞中pAKT(Ser473)及pAKT(Thr308)的蛋白表達水平較AGS-control細胞呈明顯下調。AGS-hCHIP細胞中RelA、p50、RelB及TRAF-2的蛋白表達水平較AGS-control細胞顯著下調。
　　結論: CHIP在胃癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌基因的角色，可以作為判斷胃癌侵襲、轉移以及患者預后的參考指標。在胃癌細胞株AGS細胞中高表達CHIP能顯著抑制細胞的生長、遷移以及侵襲等惡性生物學行為。高

7、表達CHIP顯著抑制了胃癌細胞株AGS細胞的生長，與細胞增殖能力減弱及細胞凋亡增多相關，Bcl-2基因的下調及AKT信號通路活性的抑制可能是其潛在的原因。高表達CHIP顯著抑制了AGS胃癌細胞株中TRAF-2-NF-κB信號通路的活性，導致了NF-κB信號通路下游一系列靶基因如ITGB1、MMP-2及MMP-9表達水平的下調，這可能是CHIP抑制胃癌細胞惡性生物學行為的重要機制之一。CHIP有望作為胃癌分子靶向治療的新靶點，應用CHIP