過氧化物酶體增殖物激活受體γ及其基因多態(tài)性與腦梗死的相關性研究.pdf

1、目的:腦梗死(ischemic stroke，IS)是繼惡性腫瘤、心臟病之后，導致全球人口死亡的三大原因之一。IS患者由于接受溶栓治療或栓子自發(fā)向遠端推移而出現缺血后的再灌注進一步加重了缺血后的腦損傷。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)激動劑在腦缺血再灌注損傷中通過減少細胞凋亡及減少腦梗死體積等有效發(fā)揮腦保護作用。熊果酸(ursol

2、icAcid，UA)作為PPARγ激動劑在過敏性哮喘中發(fā)揮抗炎作用，如若其能在腦缺血再灌注損傷過程中影響PPARγ的激活進而調控炎癥因子水平，將有望為IS藥物治療提供新的思路。同時，PPARγ基因上的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)rs1801282和rs3856806是重要的功能性SNP，可以通過影響血清PPARγ水平進一步調節(jié)患者血糖及血脂水平，增加罹患動脈粥樣硬化相關疾病的危險。

3、
　　本研究通過大鼠大腦中動脈閉塞及再灌注(middle cerebral artery occasion andreperfusion，MCAO/R)模型和IS患者臨床實驗研究PPARγ在IS急性期的作用及其分子機制并探討PPARγ基因多態(tài)性和中國人群IS的相關性。
　　研究方法:1、動物實驗:250-280g清潔級健康雄性成年SD大鼠162只，參考Longa的線栓法制備MCAO/R模型，假手術組不插入線栓，其余操作相同。

4、UA處理組于缺血再灌注后0h、24h以及47.5h給予對應劑量的UA灌胃。BADGE與UA聯合處理組于缺血再灌注后0h、24h以及47.5h后以UA灌胃及BADGE30mg/kg腹腔注射。再灌注后動物蘇醒時以及48h后處死前根據Longa的5級標準評分法評分。模型成功48h后，行TTC染色計算腦梗死體積;尼氏染色及免疫組化染色檢測PPARγ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1;ELISA檢測TNF-α、IL-1β、IL-6,Weste

5、rn blot檢測PPARγ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1及NFκB和MAPK信號通路相關蛋白。采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。顯著性水平α=0.05。2、臨床實驗:收集中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經內科住院的IS患者895例以及中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院體檢中心的健康體檢者883例。收集臨床資料并留取病例組及體檢者的外周靜脈血，提取基因組DNA，利用SNaPshot技術進行PPARγ基因多態(tài)性位點(rs1801282及r

6、s3856806)分型。運用SPSS20.0進行統(tǒng)計學分析。P＜0.05被認為有明顯統(tǒng)計學意義。
　　結果:1、動物實驗:1)各組大鼠神經功能損傷比較:再灌注48 h后，缺血再灌注組神經功能缺損評分明顯高于假手術組（P＜0.01）。應用UA干預后大鼠的神經功能缺損評分明顯改善（P＜0.01），聯合應用BADGE后，大鼠的神經功能缺損評分較單一應用UA組有明顯差異（P＜0.05），但較缺血再灌注組仍有明顯降低(P＜0.05)。2)各

7、組大鼠腦梗死體積比較:與缺血再灌注組相比，應用UA可以明顯減少大鼠梗死體積(P＜0.01)，聯合應用BADGE后，大鼠的腦梗死體積較單一應用UA組有明顯差異(P＜0.05)，但較缺血再灌注組仍有明顯減小(P＜0.05)。3)各組大鼠神經組織形態(tài)學比較:再灌注48h后，缺血再灌注組梗死區(qū)域尼氏染色可見完整神經元個數較假手術組明顯減少(P＜0.01)，應用UA干預后大鼠梗死區(qū)域內完整神經元個數明顯增多(P＜0.01);聯合應用BADGE后，

8、完整神經元個數較單一應用UA組有明顯差異(P＜0.05)，但較缺血再灌注組仍有明顯增加(P＜0.05)。4)各組大鼠腦組織中PPARγ表達水平比較:免疫組化及Western blot結果顯示與假手術組比較，缺血再灌注組腦組織內的PPARγ功能及蛋白表達下降(P＜0.01)。UA干預組PPARγ功能及蛋白表達顯著增高(P＜0.01)。聯合應用BADGE后，PPARγ功能及蛋白表達與缺血再灌注組比較沒有顯著差異（P＞0.05）。5）各組大鼠

9、梗死腦組織中TNF-α、IL-1β、IL6的水平比較:ELISA結果顯示與假手術組比較，缺血再灌注組梗死腦組織內的TNF-α、IL-1β、IL-6的水平顯著增高(P＜0.01)。與缺血再灌注組相比，UA干預組梗死腦組織內的TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低（5mg/kg組:P＜0.05;10mg/kg組及20mg/kg組:P＜0.01）。聯合應用BADGE后，梗死腦組織內的TNF-α、IL-1β、IL-6水平較單一應用UA組有

10、明顯差異(P＜0.05)，但與缺血再灌注組比較沒有顯著差異（P＞0.05）。6）各組大鼠梗死腦組織中MMP-2、MMP-9及TIMP-1的表達水平比較:免疫組化與Western blot結果顯示與假手術組比較，缺血再灌注組梗死腦組織內的MMP-2、MMP-9的蛋白表達增高(P＜0.01)，MMP-9的功能也增強(P＜0.01)。與缺血再灌注組相比，UA干預組MMP-2、MMP-9的蛋白表達顯著降低（P＜0.01），MMP-9的功能也減弱

11、P＜0.01）。聯合應用BADGE后，MMP-2、MMP-9的蛋白表達及MMP-9的功能與僅應用UA組比較有明顯差異（P＜0.01），MMP-9的蛋白表達水平及功能較缺血再灌注組仍有明顯降低（P＜0.05）。免疫組化與Western blot結果顯示與假手術組比較，缺血再灌注組梗死腦組織內的TIMP-1的蛋白表達降低（P＜0.01）。與缺血再灌注組相比，UA干預組TIMP-1的蛋白表達顯著增高(P＜0.01)。聯合應用BADGE后，TI

12、MP-1的蛋白表達與僅應用UA組比較有明顯差異(P＜0.01)，較缺血再灌注組仍有明顯增高(P＜0.05)。7)各組大鼠IS組織中MAPK信號通路相關蛋白: Western blot結果顯示與假手術組比較，缺血再灌注組梗死腦組織內的ERK1/2、p38 MAPK、JNK磷酸化水平增高(P＜0.01)。與缺血再灌注組相比，UA干預組ERK1/2、p38 MAPK、JNK磷酸化水平下降(P＜0.01)。聯合應用BADGE后，ERK1/2、p

13、38 MAPK、JNK磷酸化水平較僅應用UA組有明顯差異(P＜0.01)，但較缺血再灌注組仍有明顯增加(P＜0.01)。8)各組大鼠肺組織中NFκB信號通路相關蛋白:Western blot結果顯示與假手術組比較，缺血再灌注組梗死腦組織內的NFκB、IκB磷酸化水平增加(P＜0.01);與缺血再灌注組相比，UA干預組NFκB、IκB磷酸化水平下降(P＜0.01)。聯合應用BADGE后，NFκdB、IκB磷酸化水平較僅應用UA組有明顯差異

14、(P＜0.01)，但較缺血再灌注組仍有明顯增加(P＜0.01)。
　　2、臨床實驗:1）所有研究對象的2個SNPs基因型在抽樣群體中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。2）PPARγ基因rs1801282位點多態(tài)性在IS與對照組的頻率分布:G等位基因頻率在病例組明顯高于對照組(P＜0.001)。攜帶G等位基因的個體發(fā)生IS的危險經過Logistic回歸分析校正各種混雜因素后仍有統(tǒng)計學差異，發(fā)病危險度增加到

15、1.844倍(OR=1.844，95％CI:1.286-2.645; P＜0.001)。PPARγ基因rs3856806與對照組的頻率分布:T位基因頻率在病例組明顯高于對照組(P=0.010)。攜帶T等位基因的個體發(fā)生IS的危險經過Logistic回歸分析校正各種混雜因素后仍有統(tǒng)計學差異，發(fā)病危險度增加到1.366倍(OR=1.366，95％CI:1.077-1.733; P=0.010)。3）PPARγ基因單倍型rs1801282-r

16、s3856806的單倍型在對照組與IS組中的分布頻率:G-T單倍型IS組中的分布頻率明顯高于對照組，攜帶G-T單倍型的個體，患IS的風險率增加至2.953倍(OR=2.953;95％CI:2.082-4.190;P＜0.001)。4) PPARγ基因rs1801282的G等位基因及rs3856806的T等位基因對IS存在相乘交互作用(OR=3.404;95％CI:1.631-7.102; P＜0.001)及相加交互作用(RERI=41.

17、705;95％CI:14.586-68.824; AP=0.860;95％CI:0.779-0.940; S=8.170;95％CI:3.772-17.697)，此時為協(xié)同作用。全部IS病例中歸因于rs1801282的G等位基因及rs3856806的T等位基因交互作用引起的病例占86.0％。5）PPARγ基因rs1801282的G等位基因的對IS的作用在rs3856806的T等位基因存在下有所增強(OR=8.001 vs OR=1.84

18、4)，rs3856806的T等位基因的對IS的作用在rs1801282的G等位基因存在下也有所增強(OR=2.546 vs OR=1.366)。
　　結論:1、MCAO/R模型顯示PPARγ的表達下調伴功能減弱，UA通過激活PPARγ調節(jié)MCAO/R的大鼠腦組織內金屬蛋白酶失衡，減輕MCAO/R誘導的腦炎癥損傷，其可能機制是通過抑制NFκB及MAPK通路的磷酸化來實現其神經保護作用。2、PPARγ基因rs1801282的G等位基因