miR-101在人骨髓間充質干細胞成骨誘導分化中的作用及機制研究.pdf

1、背景:隨著人口社會老齡化的加劇，機械交通運輸行業(yè)的飛速發(fā)展，骨折延遲愈合、骨折不愈合（骨不連）、脊柱融合失敗及骨質疏松癥等骨形成障礙性疾病及相關并發(fā)癥的發(fā)病率越來越高，嚴重影響了人們的生活、學習和工作，成為臨床骨科醫(yī)師的重大難題之一。骨的形成發(fā)育是一個復雜的系統(tǒng)的生理調節(jié)過程，由多種功能細胞參與，詳細了解骨生成的分子信號機制并進行干預調控，不僅能夠延緩減輕骨質疏松癥的發(fā)生，促進骨折愈合，還能夠縮短脊柱融合時間，提高脊柱融合率。成骨細胞來

2、源于間質細胞，分泌功能強大，通過骨基質的合成、分泌和礦化，參與骨的形成，是骨生成的主要功能細胞。成骨細胞由間充質干細胞誘導分化而來，其分化時機及分化方向受嚴格的分子調控，該調控機制是由極其復雜的信號通路分子及其構成的信號通路實現。系統(tǒng)、完整地認識研究間充質干細胞成骨分化的信號轉導調控機制，是進一步研究成骨細胞分化的條件，同時也是實現骨組織工程化應用研究的重要基礎。
　　成骨細胞是由具有多向分化潛能的間充質干細胞在特定誘導條件下分化

3、而來，經典的Wnt信號通路在間充質干細胞成骨誘導分化中發(fā)揮重要作用，在調控骨的生成發(fā)育方面扮演主要角色。Wnt信號蛋白作為一類分泌型糖蛋白，主要通過旁分泌/自分泌、內分泌發(fā)揮作用。Wnt信號通路活化后抑制胞質中β-連環(huán)蛋白(β-catenin)降解，β-catenin在細胞內積累增加。β-catenin屬于蛋白質，具有多種功能，如:粘附、基因表達調控等等，在細胞連接處β-catenin與鈣粘素相互作用，參與細胞間粘合帶的形成;游離的β-

4、catenin則進入細胞核，參與基因的表達調控。研究顯示wnt信號通路分泌的糖蛋白對骨骼多種組織的發(fā)育起決定性作用。
　　微小RNA（miRNA）種類數量繁多，通常由22（約23-25）個核苷酸構成，屬于內源性非編碼單鏈小RNA分子，與靶基因mRNA3'非翻譯區(qū)相結合，一方面與胞內蛋白質結合形成RNA沉默核糖核蛋白復合物(RISC)，通過序列完全互補的方式特異結合目標mRNA，并將其降解發(fā)揮作用;另一方面通過非完全互補結合而抑制蛋

5、白質翻譯，從而在轉錄后水平參與基因的表達調控。目前，在生物體內已克隆到近千種miRNA序列，參與生物體的生長發(fā)育、細胞增殖分化、細胞凋亡、炎癥反應及腫瘤發(fā)生等眾多生理病理過程，據推測1/3的人類基因可能受到miRNA的表達調控。越來越多的證據表明miRNAs在翻譯后修飾水平參與基因的表達調控，在MSCs向成骨細胞分化的調控機制中發(fā)揮不可替代的作用，是目前的研究熱點之一。例如:miR-96、miR-124、miR-199a、miR-100

6、、miR-138、miR-204和miR-20a參與成骨細胞分化的相關研究均有報道。miR-101在人類腫瘤細胞中處于靜止狀態(tài)，大量研究表明miR-101在人體多種細胞的代謝過程中發(fā)揮根本性作用，尤其是調控細胞增殖與分化。miR-101可能參與MSCs向成骨細胞分化的調控過程，但其具體的分子機制尚未見報道。最近有證據表明EZH2蛋白抑制Wnt基因表達，導致Wnt/β-catenin信號通路失活，阻斷MSCs向成骨細胞誘導分化。
　

7、　目的:骨髓間充質干細胞通過體外原代培養(yǎng)獲得，動態(tài)監(jiān)測miR-101在間充質干細胞成骨誘導分化中的表達水平變化。利用miR-101抑制劑和模擬物，觀察改變miR-101表達水平（高表達/低表達）對MSCs成骨分化的影響，及其對靶基因EZH2水平的影響。通過觀察EZH2表達水平改變對miR-101介導的hBMSCs成骨細胞誘導分化的影響及其對Wnt/β-Catenin信號通路活性的影響，進一步揭示miR-101、EZH2及Wnt/β-Ca

8、tenin信號轉導通路之間的相互關系，為闡明miR-101在人骨髓間充質干細胞成骨分化的調控機制中的作用提供新的思路及有力的支持證據。
　　方法:1.檢測miR-101在hBMSCs成骨分化中的表達及其作用。從Cyagen生物科技公司購得成人骨髓間充質干細胞進行細胞傳代培養(yǎng)，運用qRT-PCR技術動態(tài)檢測觀察miR-101在hBMSCs成骨分化中表達水平的改變;利用慢病毒轉染技術干預改變骨髓間充質干細胞中的miR-101表達水平，

9、觀察成骨細胞的特異性標記物的表達水平、ALP活性及細胞礦化水平等，驗證miR-101在hBMSCs成骨誘導分化中的作用。
　　2.miR-101對EZH2的調節(jié)作用。在前期的實驗中，我們通過生物信息學預測分析發(fā)現miR-101與EZH2基因的3'UTR區(qū)存在堿基互補關系;Western blot分析發(fā)現高表達水平miR-101能夠顯著降低EZH2的蛋白水平，提示EZH2可能是miR-101的直接靶基因，miR-101能夠抑制EZH

10、2基因的表達。
　　3.EZH2基因調控miR-101介導的成人骨髓間充質干細胞成骨分化。我們通過構建質粒，干擾EZH2在成人骨髓間充質干細胞的表達水平，通過qRT-PCR分析技術檢測成骨細胞特異性標記物的（如RUNX2、 ALP、OPN和OCN）表達及ALP活性的改變。
　　4.Wnt信號通路在miR-101介導的成人骨髓間充質干細胞成骨分化中的作用。通過TOPflash/FOPflash技術檢測Wnt信號通路的活性，進一

11、步通過干預miR-101和EZH2的表達水平，觀察Wnt信號通路的活性改變。
　　結果:1.miR-101在hBMSCs向成骨細胞誘導分化中表達水平明顯升高;2.miR-101促進hBMSCs向成骨細胞分化;3.EZH2作為miR-101的直接靶基因之一，miR-101能夠抑制EZH2的表達;4.EZH2參與miR-101介導的hBMSCs成骨細胞誘導分化調控;5.miR-101通過靶基因EZH2，影響Wnt/β-Catenin信