白果內(nèi)酯對缺血性腦損傷的神經(jīng)保護作用及其機制研究.pdf

1、腦卒中是當前全球第三大致死類疾病，僅次于心血管疾病和癌癥，而在我國，腦卒中已成為最主要的致死因素，也是導(dǎo)致重度、慢性成人殘疾的主要原因，嚴重危害人類的生命與健康。根據(jù)其臨床發(fā)病特點不同，可以將腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類。據(jù)統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)缺血性腦卒中患者約占所有卒中患者的70％，而我國缺血性腦卒中約占所有卒中病例的85％，死亡率高達50％，存活的缺血性腦卒中患者中約有3/4不同程度地喪失勞動能力或遺留有癱瘓，失語等嚴重的

2、后遺癥。近年來人們致力于研究缺血性腦損傷急性期的神經(jīng)損傷性級聯(lián)反應(yīng)，并在動物模型上已發(fā)現(xiàn)很多具有神經(jīng)保護作用的化合物，但轉(zhuǎn)化后的臨床療效均不太理想。因此，闡明缺血性腦損傷的確切病理機制，提出新的卒中后神經(jīng)保護策略，研發(fā)療效確切并能讓更多患者受益的治療藥物仍然是當前腦卒中治療亟待解決的問題。此外，由于各種條件限制，能夠在缺血性腦損傷“黃金3小時”內(nèi)接受治療的患者很少，多數(shù)患者在急性期接受保守治療，損傷后期主要依靠神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)修復(fù)，通過促

3、進機體內(nèi)在的修復(fù)能力盡可能恢復(fù)患者的意識、感覺、認知和運動功能，并且這已經(jīng)成為卒中后護理和治療的關(guān)鍵所在。因此，發(fā)現(xiàn)促進卒中后期神經(jīng)修復(fù)的關(guān)鍵機制和分子靶標，研發(fā)理想的恢復(fù)期治療藥物也已經(jīng)成為腦卒中研究領(lǐng)域的熱點。
　　細胞自噬與凋亡是目前卒中機制研究比較重要的熱門領(lǐng)域。缺血性腦損傷后腦組織主要因供血、供氧不足會發(fā)生神經(jīng)細胞的壞死與凋亡。其中，缺血半影區(qū)腦組織主要發(fā)生細胞凋亡，一種受多基因嚴格控制的死亡方式。細胞自噬是機體內(nèi)在調(diào)整

4、穩(wěn)態(tài)的有效機制，缺血缺氧引起的細胞內(nèi)錯誤折疊或者不折疊的蛋白、受損的細胞器均需要通過自噬途徑被運送至溶酶體降解，不能夠及時被清除的病理因素會導(dǎo)致細胞凋亡或死亡。神經(jīng)細胞在缺血、缺氧情況下激活保護性細胞自噬減少凋亡相關(guān)蛋白向線粒體內(nèi)的聚集，通過減少細胞色素C或Caspase-3的活化從而抑制細胞凋亡。因此，研發(fā)可以靶向調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞保護性自噬并抑制細胞凋亡的藥物，能夠在缺血性腦損傷早期減少神經(jīng)細胞死亡，減輕神經(jīng)功能損傷。
　　銀杏是一

5、種有著較早文獻記載并具有重要藥用價值的天然植物，在我國作為藥用已有五千多年的歷史，長期應(yīng)用于防治心血管疾病，抗老防衰，抗癌和提高自身免疫力等方面。研究表明，銀杏葉和銀杏果中含有多種藥用成分可用于多種疾病的防治，成分主要是銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、M和白果內(nèi)酯(bilobalide，BB)。其中白果內(nèi)酯是從銀杏葉中提取出的唯一一種倍半萜內(nèi)酯，具有抗興奮性毒性、抑制氧化應(yīng)激損傷、抗炎以及抗血小板聚集等作用，主要以與其他銀杏葉提取物聯(lián)合制劑的形

6、式應(yīng)用于腦血管相關(guān)疾病的臨床治療。目前白果內(nèi)酯含量較高的制劑是用于腦部、周圍血流循環(huán)障礙的銀杏葉提取物注射液金納多（白果內(nèi)酯含量約占標準提取物的2.9％）;另有金閣萊(@)銀杏內(nèi)酯注射液，其中白果內(nèi)酯含量高達48％，主要用于缺血性腦卒中恢復(fù)期腦梗死適應(yīng)癥的治療。然而，盡管臨床應(yīng)用表明含白果內(nèi)酯的混合制劑對腦卒中具有較好的療效，但其具體有效成分不明，白果內(nèi)酯單體對缺血性腦卒中急性期和恢復(fù)期的療效和確切機制也不清楚，因此也限制了其在缺血性腦

7、損傷及適應(yīng)癥治療中的應(yīng)用。本課題在前期研究發(fā)現(xiàn)含有白果內(nèi)酯的銀杏內(nèi)酯注射液能夠減輕缺血性腦卒中急性期損傷的基礎(chǔ)上，進一步研究白果內(nèi)酯對小鼠大腦中動脈阻塞(transient MiddleCerebral Artery Occlusion，tMCAO)形成的局灶性缺血性腦損傷急性期和恢復(fù)期神經(jīng)損傷及其神經(jīng)功能恢復(fù)的治療作用，并闡明其相關(guān)機制。
　　第一部分白果內(nèi)酯對缺血性腦損傷急性期神經(jīng)保護作用及其與自噬的相關(guān)性
　　目的:建

8、立小鼠缺血性腦損傷再灌注(Ischemia/Reperfusion，I/R)模型，研究白果內(nèi)酯對急性期神經(jīng)損傷的保護作用，及對神經(jīng)元自噬和凋亡的調(diào)節(jié)，為深入闡明白果內(nèi)酯的作用機制并拓展其臨床應(yīng)用積累學(xué)術(shù)基礎(chǔ)。
　　方法:(1)參考Longa法制備小鼠tMCAO模型，于缺血1h、血流再灌注6h后分組給予金納多(10 mg/kg)，3.5 mg/kg，7 mg/kg和14 mg/kg白果內(nèi)酯(BB，i.p.，bid)治療。血流再灌注7

9、2h后神經(jīng)功能評分，處死取材TTC染色，腦含水量測定。(2)制備小鼠tMCAO模型，并選取最小有效劑量7 mg/kgBB于血流再灌注6h后給藥，再灌注72h后處死分別取組織腦片和缺血半影區(qū)腦組織，利用免疫組織化學(xué)方法標記缺血半影區(qū)NeuN+神經(jīng)元，免疫熒光測定自噬相關(guān)蛋白LC3和凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase3與神經(jīng)元的共標情況，Western Blot法分別對缺血半影區(qū)組織LC3，p62，Beclin1，BcL-2，Bax

10、和Cleaved-Caspase3等指標進行檢測。(3)離體培養(yǎng)神經(jīng)元細胞株N2a經(jīng)離體氧糖剝奪模型（oxygen glucose deprivation，OGD）3h后，分別復(fù)糖復(fù)氧(Reoxygenation)0、3、6、12和24h，Western Blot法分別檢測胞內(nèi)LC3、p62、Beclin1、BcL-2、Bax和Cleaved Caspase-3等蛋白水平，觀察復(fù)糖復(fù)氧后不同時間點自噬和凋亡的水平，并選擇合適復(fù)糖復(fù)氧時間

11、。(4) N2a細胞OGD3h后，用含不同濃度BB(0.01、0.1、1、10、25和50μM)的完全培養(yǎng)基復(fù)糖復(fù)氧24h，MTT法評價藥物對細胞活力的影響。(5)N2a細胞OGD3h后，用含有1μM BB的完全培養(yǎng)基復(fù)糖復(fù)氧24h，利用Western Blot法分別進行自噬相關(guān)蛋白LC3、p62和凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3等指標進行檢測。(6) N2a細胞OGD3h后，同時給予細胞含2.5 mM自噬抑制劑3MA和1

12、μM BB的完全培養(yǎng)基復(fù)糖復(fù)氧24h，利用流式細胞儀和Western Blot法檢測細胞凋亡。
　　結(jié)果:(1) BB(7，14 mg/kg)能夠減少小鼠腦梗死體積，降低神經(jīng)功能評分和腦含水量。(2)7 mg/kg BB能夠減少tMCAO模型后小鼠缺血半影區(qū)神經(jīng)元的丟失。(3)7 mg/kg BB能夠升高模型72h后小鼠缺血半影區(qū)腦組織LC3熒光表達并抑制Cleaved Caspase-3熒光表達，其中LC3與Cleaved Ca

13、spase-3熒光都與神經(jīng)元細胞有部分共標。(4)7 mg/kg BB治療能夠降低小鼠缺血半影區(qū)腦組織凋亡相關(guān)蛋白Bax，Cleaved Caspase-3，自噬底物蛋白p-62蛋白的表達，并升高BcL-2、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達。(5) N2a細胞OGD/R后3h自噬水平較對照組升高，并隨著時間推移細胞自噬水平下降，而細胞凋亡水平上升。(6) WB結(jié)果顯示，BB促進復(fù)糖復(fù)氧24h后N2a細胞BcL-2、LC3-Ⅱ和Be

14、clin-1的蛋白表達，并降低Bax，Cleaved-Caspase3，自噬底物蛋白p-62蛋白表達。(7)自噬抑制劑3MA能夠部分取消BB對Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達的抑制作用;流式細胞術(shù)結(jié)果顯示白果內(nèi)酯能夠減少處于早期凋亡和晚期凋亡及壞死的細胞數(shù)目，而3MA部分取消BB對N2a細胞凋亡的抑制作用。
　　結(jié)論:自噬參與白果內(nèi)酯對缺血性腦損傷急性期的神經(jīng)保護作用。
　　第二部分白果內(nèi)酯對缺血性腦損傷恢

15、復(fù)期神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)及其機制
　　目的:研究BB對缺血性腦損傷恢復(fù)期神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)作用，闡明其對成體神經(jīng)干細胞增殖、分化等功能的影響與機制，為揭示其腦卒中恢復(fù)期用藥的促神經(jīng)修復(fù)功能提供直接的實驗依據(jù)。
　　方法:參考Longa法制備小鼠I/R損傷模型，缺血1h、血流再灌注24h后利用神經(jīng)功能評分進行模型篩選，將模型成功小鼠隨機分為模型對照組（Vehicle組），白果內(nèi)酯3.5 mg/kg、7 mg/kg和14 mg/kg給藥組

16、(BB3.5 mg/kg，7 mg/kg，14 mg/kg，i.p.，bid)，給藥14天和42天分別進行內(nèi)源神經(jīng)干細胞增殖和分化相關(guān)實驗:(1)統(tǒng)計術(shù)后各組小鼠死亡率和體重，并分別于術(shù)后1、3、7、14、28和42天進行神經(jīng)功能評分，3、7、14、28和42天進行踏空測試，于術(shù)后14和28天進行轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)棒測試，分別記錄小鼠足失誤次數(shù)、右轉(zhuǎn)率和從轉(zhuǎn)棒滑落時間，評價BB對I/R損傷恢復(fù)期小鼠神經(jīng)感知、運動功能的影響。(2)術(shù)后38-42天

17、對小鼠進行Morris水迷宮測試，評價BB對小鼠空間學(xué)習與記憶能力的影響。(3)利用小動物MRI-T2加權(quán)成像技術(shù)在術(shù)后24h、7d、14d和42d在體觀察模型及14 mg/kg BB治療組小鼠腦組織損傷情況。(4)術(shù)后12-13天給予小鼠腹腔注射BrdU(5-Bromo-2-deoxy Uridine，Sigma;50 mg/kg，連續(xù)給藥4次，給藥間隔為12h)標記S期增殖細胞，術(shù)后14天用于研究干細胞增殖的小鼠灌注取腦，完成Brd

18、U免疫組化，評價干細胞增殖情況;用于研究干細胞分化的小鼠于術(shù)后42天灌注取腦，完成BrdU/NeuN免疫熒光，評價干細胞向神經(jīng)元定向分化的情況;同時，為探討藥物對神經(jīng)再生調(diào)節(jié)的機制，離體實驗培養(yǎng)成體神經(jīng)干細胞研究藥物對干細胞存活、增殖和分化的影響，并初步探討其作用機制。(5)離體培養(yǎng)成體神經(jīng)干細胞(Adult neural stem cells，ANSCs)，利用MTT和細胞計數(shù)法分別觀察OGD/R和不同濃度BB（0.01、0.1、1、

19、10和50μM）給藥對神經(jīng)干細胞細胞活力和自我更新的影響。(6)利用BrdU免疫熒光標記法和流式細胞術(shù)評價BB對干細胞增殖和細胞周期的影響。(7)利用免疫熒光標記法觀察OGD/R7天后神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元（Tuj-1）和星形膠質(zhì)細胞(GFAP)分化的比率以及不同濃度BB（0.1、1和10μM）對干細胞定向分化能力的影響。(8)檢測OGD/R24h后，Western Blot法檢測不同濃度BB(0.1，1和10μM)對細胞p-Akt，p-p

20、38和p-JNK水平的變化影響。(9)利用JNK激動劑茴香霉素(Anisomycin，Anis)預(yù)處理干細胞24h后，OGD2h后復(fù)糖復(fù)氧給予BB和Anis干預(yù)7天，免疫熒光法觀察OGD/R7天后BB對神經(jīng)干細胞向Tuj-1神經(jīng)元分化的影響。
　　結(jié)果:(1) BB(7，14 mg/kg)治療小鼠長期存活率高于I/R模型小鼠，并且BB可以緩解I/R損傷導(dǎo)致的小鼠體重降低。(2)與模型對照組小鼠相比，7和14 mg/kg BB治療組

21、小鼠神功功能顯著改善，轉(zhuǎn)角測試中右轉(zhuǎn)率降低，轉(zhuǎn)棒測試中棒上停留時間延長，同時，在踏空測試中踏空率顯著降低。(3) Morris水迷宮定位航行測試中，BB能夠降低小鼠找到水下平臺的時間，同時在空間探索測試中BB能夠增加小鼠穿越平臺次數(shù)，增加小鼠在平臺象限穿越的時間及次數(shù)。(4) MRI觀察到術(shù)后24h模型小鼠損傷側(cè)腦組織存在大面積高亮度信號，7天后信號變?nèi)醪⒊霈F(xiàn)腦組織缺損，14天時組織缺損邊緣出現(xiàn)高密度信號，42天組織梗死導(dǎo)致的缺損體積相

22、對固定，而給予14 mg/kg BB治療能夠延遲腦組織缺損的出現(xiàn)并減少梗死導(dǎo)致的腦組織缺損。(5)7 mg/kg和14 mg/kg BB增加術(shù)后14天小鼠SVZ和SGZ神經(jīng)干細胞的數(shù)目和分布范圍。(6)7 mg/kg和14 mg/kgBB增加術(shù)后42天小鼠SVZ和SGZ區(qū)BrdU+/NeuN+細胞數(shù)目。(7)0.1、1、10和50μM BB能夠增加OGD/R后ANSCs細胞活力且能夠增加生長7天后神經(jīng)球直徑和個數(shù)。(8) BB增加OGD

23、/R后BrdU+的ANSCs數(shù)目，并且能夠增加處于S期的細胞數(shù)目。(9) BB促進OGD/R7天后ANSCs向Tuj-1+神經(jīng)元的分化。(10) BB抑制OGD/R后ANSCs內(nèi)p38和JNK的磷酸化水平的升高，同時升高Akt的磷酸化水平。(11)10μM JNK激動劑茴香霉素取消BB促進ANSCs向神經(jīng)元分化的作用。
　　結(jié)論: BB促進缺血性腦損傷恢復(fù)期神經(jīng)再生，增強神經(jīng)功能修復(fù)。綜上所述，本文工作的主要創(chuàng)新之處在于:

24、　　1.發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯在I/R模型小鼠急性期的抗凋亡作用與調(diào)節(jié)自噬相關(guān)
　　通過對I/R經(jīng)典動物模型研究發(fā)現(xiàn)，白果內(nèi)酯對缺血性腦損傷的急性期損傷包括神經(jīng)運動障礙、腦梗死和腦水腫均具有顯著改善作用，并且白果內(nèi)酯可以促進神經(jīng)元自噬并抑制神經(jīng)元凋亡;同時，離體研究證實白果內(nèi)酯通過促進神經(jīng)細胞自噬并抑制神經(jīng)元凋亡。研究為揭示白果內(nèi)酯在缺血性腦損傷急性期的神經(jīng)保護作用提供了直接的實驗證據(jù)，為拓展其在缺血性腦損傷急性期的臨床應(yīng)用積累了重要學(xué)術(shù)基

25、礎(chǔ)。
　　2.發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)醅在小鼠缺血性腦損傷恢復(fù)期發(fā)揮促神經(jīng)再生作用
　　研究發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯能改善缺血性腦損傷恢復(fù)期神經(jīng)運動功能，并且能促進內(nèi)源性神經(jīng)再生。同時，離體實驗確證白果內(nèi)酯能夠促進成體神經(jīng)干細胞存活、自我更新、增殖和向神經(jīng)元的分化，并且其對分化的積極作用與其對神經(jīng)干細胞JNK MAPK通路的抑制作用相關(guān)。研究深化了對白果內(nèi)酯應(yīng)用于缺血性腦損傷臨床恢復(fù)期的作用機制的認識，并為推廣白果內(nèi)酯聯(lián)合制劑和單體制劑在防治缺血性腦