長鏈非編碼RNA-n346372在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相關基因研究.pdf

1、目的:
　　1.基于全轉錄組高通量測序結果，篩選在膀胱癌組織與癌旁組織中顯著差異表達的lncRNA分子;
　　2.驗證lncRNA-n346372在膀胱癌組織與癌旁組織，膀胱癌細胞系中的表達差異情況，以及與患者臨床病理信息的相關性;
　　3.探討lncRNA-n346372在膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學功能中的作用;
　　4.進一步分析驗證lncRNA-n346372與mRNA Cyclin B1的相

2、關性，預測可能涉及的調(diào)控網(wǎng)絡。
　　方法:
　　1.通過新一代測序技術，對10對膀胱癌組織/癌旁組織進行全轉錄組高通量測序，采用Wilcoxon rank sum test、DESeq2、EdgeR等統(tǒng)計學分析方法，以p＜0.05、fdr＜0.05、log2FoldChange＞2為篩選策略，對測序結果中差異表達的lncRNA進行再次篩選，為后續(xù)驗證縮小范圍;
　　2.提取40對膀胱癌/癌旁組織，及5個不同惡性程度的膀

3、胱癌細胞系中的RNA，反轉錄成cDNA，采用Real Time qPCR技術和FISH技術對上述篩選結果中l(wèi)ncRNAn346372的表達情況進行進一步組織和細胞水平的驗證，同時對不同腫瘤級別中l(wèi)ncRNAn346372中的表達量進行t test比較分析，明確其相關性;
　　3.分別構建lncRNA-n346372 shRNA T24慢病毒及過表達5637穩(wěn)轉細胞株，通過CCK-8，小室，流式等實驗技術，觀察不同處理組相對對照組細

4、胞功能變化情況;
　　4.在高通量測序發(fā)現(xiàn)的眾多差異表達lncRNA及mRNA的基礎上，通過生物信息學的相關性分析，預測可能與lncRNA-n346372相關的mRNA分子，進一步通過RealTime qPCR，免疫組化，Weston Blot等技術驗證兩者在組織和細胞表達水平的相關性，為后續(xù)功能相關性以及調(diào)控機制研究提供前提依據(jù)。
　　結果:
　　1.按照上述策略，共篩選出32條log2FoldChange＞2的ln

5、cRNAs，其中差異倍數(shù)＞3的lncRNAs共9條，lncRNA-n346372 T/N的差異倍數(shù)最高，為3.96倍;Tumor組的相對表達量平均值為4.29，Normal組為0.20;
　　2.40對組織中有18對膀胱癌組織大于癌旁組織，腫瘤組的表達量顯著高于對照組(P＜0.05)，并在FISH實驗中得以證實。在高級別腫瘤組織中的表達高于低級別腫瘤組織(P＜0.05)。在T24(高侵襲性)膀胱癌細胞株的表達量顯著高于5637（低

6、侵襲性）膀胱癌細胞系;
　　3.成功構建干擾/過表達穩(wěn)轉膀胱癌細胞株，干擾T24膀胱癌細胞內(nèi)的lncRNA-n346372表達后后，其增殖能力、遷移及侵襲能力受到抑制，而過表達后細胞增殖、遷移及侵襲能力顯著增強。
　　4.生物信息學相關性分析顯示lncRNA-n346372與細胞周期蛋白Cyclin B1具有顯著相關性(P＜0.05)，相關系數(shù)r=0.76。并在組織核酸水平的驗證中得以證實，而且免疫組化、Weston Blo

7、t實驗發(fā)現(xiàn)Cyclin B1在膀胱癌組織中表達水平高于癌旁組織。干擾lncRNA-n346372的細胞株的Cyclin B1的表達量顯著低于對照組。
　　結論:
　　1.LncRNA-n346372在膀胱癌組織的表達量顯著高于癌旁組織，病理級別越高lncRNA-n346372的表達量越高，與惡性表型存在顯著相關性。
　　2.LncRNA-n346372參與膀胱癌細胞的增殖、遷移及侵襲等功能
　　3.LncRNA-