兔髓核間充質(zhì)干細胞移植治療退變椎間盤的實驗研究.pdf

1、實驗目的:
　　研究髓核間充質(zhì)干細胞和髓核細胞修復退變椎間盤能力的差異，為髓核間充質(zhì)干細胞治療退變椎間盤的進一步應用提供實驗根據(jù)。
　　實驗方法:
　　1.髓核間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及生物活性檢測:髓核間充質(zhì)干細胞是通過流式細胞分選術(shù)獲得并培養(yǎng)，并進行成骨、成軟骨、成脂細胞誘導分化實驗。成骨分化檢測包括堿性磷酸酶染色和和茜素紅染色。成軟骨分化與成脂肪檢測分別是通過甲苯胺藍染色鑒定與油紅O染液染色完成。
　　2.髓

2、核細胞的分離培養(yǎng)及生物活性檢測:髓核細胞是通過細胞貼壁法獲得并培養(yǎng)，進行增殖能力的檢測、Ⅱ型膠原染色和甲苯胺藍染色。
　　3.實驗分組:將32只兔子進行退變椎間盤模型建立，造模后隨機分為A、B、C、D組，分別為空白對照組，髓核間充質(zhì)干細胞移植組，髓核細胞移植組，單純培養(yǎng)液對照組。
　　4.影像學檢查:在細胞移植ld前及細胞移植12w后，行X線檢查以評估椎間盤高度指數(shù)(DHI％)，行MRI檢查以計算髓核區(qū)域相對信號強度(RSI

3、)。
　　5.PCR檢測:提取總RNA，把內(nèi)參引物序列GAPDH的表達量除膠原蛋白Ⅱ、蛋白聚糖的表達量，得到膠原蛋白Ⅱ、蛋白聚糖的相對表達量。
　　6.蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白定量檢測。
　　7.統(tǒng)計學分析:選用spss20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，組間進行單因素方差分析，以P＜0.05表示統(tǒng)計學差異顯著，P＞0.05表示無明顯統(tǒng)計學差異。
　　實驗結(jié)果:
　　1.

4、髓核間充質(zhì)干細胞在成骨誘導分化及檢測中，堿性磷酸酶染色和和茜素紅染色均顯示陽性顯色。在成軟骨和成脂誘導分化及檢測中見甲苯胺藍染色見細胞呈藍色，并有大小不等的脂滴形成。
　　2.兔原代髓核細胞呈圓形，形態(tài)大小均一。細胞增殖活力在早期較低，而在5d-13d時明顯增強。甲苯胺藍染色與Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色見陽性。
　　3.在移植12w后，B組的高度指數(shù)(DHI％)與其他組相比明顯增高，有顯著性差異(P＜0.05)。B組的RSI值

5、比C組明顯增強，顯著性差異(P＜0.05)。
　　4.在PCR檢測和蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白定量檢測可知，B組在蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白的基因表達水平高于其他組，有統(tǒng)計學意義。B組比C組蛋白聚糖的蛋白表達水平高，有顯著性差異，但四組在Ⅱ型膠原蛋白表達水平上差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　實驗結(jié)論:
　　髓核間充質(zhì)干細胞與髓核細胞均能提高退變椎間盤內(nèi)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白基因水平的表達，促進退變椎間盤的修復，但髓核間