Rab6蛋白在果蠅S2細胞抗病毒吞噬中的作用.pdf

1、Rab GTPase蛋白是小分子GTP結合蛋白(small GTP-binding proteins)中最大的亞家族，它調節(jié)和控制細胞器之間的膜通訊。Rab蛋白作為囊泡運輸?shù)姆肿娱_關，與其上游調控因子和下游特定的效應子相互作用，在囊泡的形成、轉運、粘附、錨定、融合等過程中起重要作用。然而，Rab GTPase蛋白在免疫系統(tǒng)中的作用有待于深入研究。
　　 本實驗室前期研究表明，Rab蛋白超家族成員Rab6參與對蝦抗病毒免疫的一條可

2、能途徑是，通過與β-actin的互作，調控對蝦血細胞的吞噬活性。因為日本對蝦和模式生物果蠅同屬于節(jié)肢動物門，且它們的Rab6蛋白同源性達到90.47％，所以可以使用果蠅S2細胞模擬蝦血細胞的吞噬過程，來研究其對果蠅C病毒(DCV)的吞噬過程，進而獲得對于Rab6蛋白在無脊椎動物抗病毒細胞吞噬中作用的認識。
　　 為了了解Rab6蛋白在果蠅細胞吞噬中的作用，我們采用具有吞噬能力的果蠅S2細胞進行試驗。首先，我們需要證明S2細胞中R

3、ab6蛋白能夠表達，所以我們制備Rab6的特異性抗體，再進行Western Blot分析，結果表明Rab6蛋白在S2細胞中能夠正常表達。根據(jù)本試驗室對蝦研究結果，Rab6蛋白通過與β-actin蛋白互作調控吞噬，因此本研究構建Rab6與actin的重組表達質粒，并將這2種質粒共轉染S2細胞，隨后進行免疫共沉淀試驗，結果顯示在S2細胞中Rab6蛋白與actin蛋白存在相互作用。這表明Rab6蛋白可能通過與actin蛋白互作參與細胞吞噬。<

4、br>　　 為了進一步認識Rab6蛋白對細胞吞噬中的調控作用，一方面，我們在果蠅S2細胞中采用RNA干擾技術敲低Rab6基因的表達，Real-time PCR和Western blot檢測Rab6基因轉錄和翻譯的結果表明，Rab6特異的siRNA作用后，Rab6 mRNA和Rab6蛋白表的達水平大幅度降低；此時使用滅活的FITC標記的DCV病毒進行吞噬活性的檢測，發(fā)現(xiàn)在Rab6蛋白表達被抑制的條件下，細胞的吞噬活性大幅度降低。另一方面

5、，我們使用轉染重組表達質粒的方法使Rab6基因上調表達，結果發(fā)現(xiàn)Rab6蛋白的轉錄和翻譯水平顯著升高，DCV病毒的吞噬試驗表明S2細胞的吞噬活性隨著Rab6蛋白的表達水平升高而上升。在上述試驗的基礎上，本研究采用共轉染Rab6特異的siRNA(抑制S2內源Rab6的表達)和合同義突變Rab6基因的表達質粒(缺乏Rab6-siRNA的作用位點，產生外源Rab6蛋白)到S2細胞，結果發(fā)現(xiàn)Rab6的轉錄和翻譯水平均恢復到正常水平，此時S2細胞

6、的吞噬活性也恢復到正常水平。以上結果說明Rab6蛋白確實能夠調控S2細胞的吞噬活性。
　　 為了研究Rab6蛋白調控細胞吞噬后的抗病毒作用，本研究對具有感染能力的DCV病毒對S2細胞感染后的感染復數(shù)(MOI)進行檢測。結果表明，在Rab6蛋白的表達被抑制時，被病毒感染的S2細胞內的DCV濃度較未被抑制的對照組上升；當Rab6表達上調時，DCV的濃度較對照組下降；而干擾內源Rab6表達然后導入外源的Rab6后，細胞內的DCV濃度較

7、對照組降低。以上結果證明Rab6蛋白具有調控細胞抗病毒吞噬的功能。
　　 為了觀察Rab6蛋白參與S2細胞吞噬病毒的整個過程，我們使用熒光染料標記Rab6-actin蛋白復合體，并使用激光共聚焦顯微鏡進行觀測。結果表明，在從吞噬開始發(fā)生到病毒被吞入細胞內的整個過程中，細胞吞噬病毒的部位，Rab6蛋白的表達量顯著上升，證明Rab6蛋白確實能夠參與細胞的抗病毒吞噬，發(fā)揮重要作用。
　　 綜上所述，Rab蛋白超家族成員Rab6