HIF-糖酵解-有氧氧化通路異常在非霍奇金淋巴瘤中的作用機(jī)制及干預(yù)研究.pdf

1、背景：傳統(tǒng)化療藥物大多針對(duì)快速分裂的細(xì)胞，因腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性大，除快速增殖的腫瘤細(xì)胞群落外，尚存在增殖緩慢的腫瘤細(xì)胞群落，此外，正常組織細(xì)胞中同樣存在不斷分裂增殖的細(xì)胞。因此單純應(yīng)用傳統(tǒng)化療藥物往往面臨著療效有限且殺傷正常組織細(xì)胞等不足。因此如何增加藥物的靶向性，提高藥物療效以及安全性顯得尤為重要。20世紀(jì)20年代提出的Warburg效應(yīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的代謝特征：即使在有氧環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞依然依賴(lài)糖酵解而非有氧氧化來(lái)滿(mǎn)足腫瘤自身的能量及生物

2、合成需求。腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解與腫瘤形成的因果關(guān)系尚存爭(zhēng)議，在淋巴瘤中的研究正逐步開(kāi)展。有研究表明，腫瘤細(xì)胞代謝表型的改變?yōu)镻I3K/Akt/mTOR、HIF-1α以及原癌基因c-MYC等基因主動(dòng)調(diào)控的代謝重編程所致，而非腫瘤細(xì)胞因有氧氧化主要結(jié)構(gòu)線粒體受損而導(dǎo)致的被動(dòng)應(yīng)答，且此種代謝表型偏倚可逆。
　　目的：初發(fā)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（Diffuse Large B-cell Lymphoma，DLBCL）患者腫瘤組織中HIF-1α

3、、糖酵解及有氧氧化相關(guān)關(guān)鍵蛋白表達(dá)與患者的預(yù)后分析；糖酵解抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose，2DG）、mTOR抑制劑雷帕霉素（rapamycin，RAPA）增加彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤SUDHL-4與 Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞株對(duì)阿霉素（Doxrubicin，DOX）敏感性的機(jī)制研究，以及分別聯(lián)用有氧氧化抑制劑寡霉素（Oligomycin，OM）探究雙代謝通路抑制對(duì)化療藥DOX的增敏作用；探究蛋白酶體抑制

4、劑硼替佐米（Bortezomib，BTZ）單獨(dú)應(yīng)用及聯(lián)用OM后對(duì)SUDHL-4與Raji細(xì)胞株的作用機(jī)制。
　　方法：對(duì)83例初發(fā)DLBCL患者免疫組化、血清生化、PET/CT代謝活性等進(jìn)行回顧性分析，檢測(cè)患者淋巴瘤組織中糖酵解及有氧氧化通路相關(guān)蛋白低氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、己糖激酶（hexokinaseⅡ，HKⅡ）與琥珀酸脫氫酶（succinodehydrogenase

5、，SDHA）蛋白表達(dá)水平并進(jìn)行預(yù)后分析。為研究2DG與RAPA是否增加DLBCL與Burkitt淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）細(xì)胞株對(duì)DOX的敏感性；RAPA是否同樣具有抑制糖酵解途徑的作用；以及聯(lián)用有氧氧化抑制劑OM后通過(guò)對(duì)糖酵解與有氧氧化的雙重抑制，是否更加顯著增敏DOX對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤SUDHL-4與Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞株的殺傷作用；首先體外培養(yǎng)SUDHL-4與Raji細(xì)胞，以正常人外周血淋巴細(xì)胞

6、為對(duì)照，CCK8法檢測(cè)OM與RAPA對(duì)正常淋巴細(xì)胞及淋巴瘤細(xì)胞的增殖抑制率；將2DG、RAPA與DOX聯(lián)合作用，以及在OM與RAPA合用背景下與DOX聯(lián)合作用于SUDHL-4及Raji細(xì)胞株，應(yīng)用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率；Glucose（HK）Assay Kit檢測(cè)葡萄糖消耗、乳酸（Lactic acid，LD）測(cè)試盒檢測(cè)乳酸含量及Succinate Colorimetric Assay Kit檢測(cè)琥珀酸生成； Western Bl

7、ot檢測(cè)HIF-1α及其下游血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以及糖酵解途徑關(guān)鍵酶HKⅡ、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDHA）及有氧氧化關(guān)鍵酶SDHA蛋白表達(dá)水平；反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR（Reverse transcription and quantitative real-time PCR，RT-qPCR）檢測(cè)HIF-1α、HKⅡ、LDHA及SD

8、HA基因轉(zhuǎn)錄水平；流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期。為探索BTZ與OM聯(lián)用對(duì)DLBCL與BL細(xì)胞株的作用效應(yīng)及機(jī)制，將不同濃度BTZ單用及與OM聯(lián)用于Raji和SUDHL-4細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率；代謝試劑盒檢測(cè)葡萄糖、乳酸和琥珀酸濃度；RT-qPCR檢測(cè)代謝途徑關(guān)鍵酶及蛋白的基因轉(zhuǎn)錄水平變化；Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡。

9、　　結(jié)果：83例初發(fā)DLBCL患者回顧性分析，單因素分析顯示初發(fā)DLBCL患者Ki67、LDH、PET/CT檢測(cè)SUVmax、IPI、Ki67hiBCL-2+、HIF-1α、HKⅡ與SDHA等與PFS和OS顯著相關(guān)。HIF-1α、HKⅡ、SDHA均異常表達(dá)組（HIF-1α+ HKⅡhi SDHAlo，H-H-S）與不全異常表達(dá)組（non H-H-S），兩組間的預(yù)后危險(xiǎn)因素LDH、Ki67、初發(fā)SUVmax、IPI評(píng)分均具有顯著的組間差異

10、（P<0.05）。H-H-S組與non H-H-S組的3年P(guān)FS率分別為14.3％與78.3%（P=0.001），3年OS率分別為14.3%與89.9%（P=0.000）。CCK8法測(cè)得RAPA作用48 h對(duì)淋巴瘤細(xì)胞株Raji和SUDHL-4的IC50值分別為（148.198±0.007）nM與（139.866±6.812）nM；OM作用48 h對(duì)Raji和SUDHL-4細(xì)胞的IC50值分別為（0.306±0.040）μg/ml和（0

11、.331±0.004）μg/ml。而RAPA與OM對(duì)正常淋巴細(xì)胞的IC50值分別為（608.698±20.324）nM和（2.058±0.932）μg/ml，顯著高于其對(duì)淋巴瘤細(xì)胞株的IC50值（P<0.01）。2DG及RAPA分別與DOX聯(lián)用均可協(xié)同抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖；抑制細(xì)胞葡萄糖攝取及乳酸生成。研究發(fā)現(xiàn)RAPA對(duì)糖酵解及其聯(lián)用DOX具有更加顯著的抑制效果，因此后續(xù)選用RAPA作為糖酵解抑制劑與有氧氧化抑制劑OM聯(lián)用，通過(guò)同時(shí)抑制糖

12、酵解與有氧氧化的雙代謝途徑繼而聯(lián)用 DOX，上述抑制作用則更加顯著，此外與糖酵解及有氧氧化相關(guān)關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡均被顯著協(xié)同抑制。蛋白酶體抑制劑BTZ單藥作用SUDHL-4及Raji細(xì)胞可顯著抑制細(xì)胞增殖且呈劑量依賴(lài)性；不同程度抑制原癌基因c-MYC、HIF-1α及其下游VEGF和GLUT1、糖酵解關(guān)鍵酶（HKⅡ、LDHA）以及有氧氧化關(guān)鍵酶（SDHA）的轉(zhuǎn)錄與翻譯；抑制葡萄糖消耗、糖酵解代謝產(chǎn)物乳酸及有氧氧化代

13、謝產(chǎn)物琥珀酸生成；促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡且呈劑量依賴(lài)性。與有氧氧化抑制劑OM聯(lián)用時(shí)，以上抑制作用顯著協(xié)同增強(qiáng)。
　　結(jié)論：以HIF-1α、HKⅡ、SDHA為代表的HIF-1α-糖酵解-有氧氧化通路在初發(fā)DLBCL患者中的異常表達(dá)可預(yù)測(cè)患者預(yù)后。糖酵解抑制劑2DG、mTOR抑制劑RAPA及蛋白酶體抑制劑BTZ均有顯著抑制淋巴瘤細(xì)胞糖酵解的作用，與傳統(tǒng)化療藥DOX聯(lián)用可通過(guò)下調(diào)HIF-1α從而有效抑制SUDHL-4及Raji細(xì)胞株糖酵解通路

14、，進(jìn)而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。且在與OM作用條件下，通過(guò)對(duì)糖酵解及有氧氧化的雙重抑制，其抑制細(xì)胞的能量代謝與增殖以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用顯著優(yōu)于代謝單通路抑制，協(xié)同機(jī)制可能與聯(lián)用后同時(shí)抑制糖酵解及有氧氧化兩條代謝途徑有關(guān)。以上均提示抑制雙代謝通路可能成為治療非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin Lymphoma，NHL）的新策略。提示 HIF-1α-糖酵解-有氧氧化通路異?？赡苁欠腔羝娼鹆馨土龅闹匾攸c(diǎn)，RAPA聯(lián)合OM有望作為雙代謝通路抑