超聲靶向微泡介導CD133-shRNA轉染對CD133+肝癌干細胞生物學特性及上皮間質轉化的影響.pdf

1、背景和目的：
　　原發(fā)性肝癌為全球常見的惡性腫瘤之一，肝癌治療的預后差與其高轉移性密切相關。越來越多的研究證實，腫瘤細胞中存在一些具有自我更新能力的特殊亞群，稱為腫瘤干細胞或腫瘤啟始細胞，腫瘤干細胞具有維持和促進腫瘤生長的特性，可能是腫瘤發(fā)生、轉移、復發(fā)、治療抵抗的根源。
　　CD133是由PROM-1基因編碼的5次跨膜糖蛋白，作為分離培養(yǎng)和鑒定肝癌干細胞的特異性標志之一。CD133+肝癌細胞在自我更新、增殖、分化、成瘤、放

2、化療抵抗等方面均表現(xiàn)出干細胞的特性，CD133還與腫瘤的惡性進展、預后及復發(fā)率密切相關。
　　上皮間質轉化是上皮細胞在某些基因和特定環(huán)境作用下轉化為具有間質細胞表型的生物學過程，其在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)展以及腫瘤轉移等過程中發(fā)揮了重要作用。目前研究證實，上皮間質轉化和腫瘤干細胞之間有著密切的關聯(lián)，腫瘤細胞經(jīng)過上皮間質轉化可表現(xiàn)出腫瘤干細胞的特性。
　　超聲靶向微泡破壞作為一種新型的基因傳輸方法及靶向給藥系統(tǒng)備受關注，它可以成功地

3、將RNA干擾技術和聲脈沖、超聲等技術相結合，提高局部組織、細胞的基因轉染導入效率和靶向性，有望成為一種安全、簡便、高效的基因治療方法。
　　本研究的目的在于探討超聲靶向微泡介導shRNA對CD133+肝癌干細胞進行基因轉染的可行性，并且比較不同轉染方式的基因轉染效率差異；研究超聲靶向微泡介導CD133-shRNA轉染后對CD133+肝癌干細胞生長、增殖、侵襲能力以及成瘤能力影響；研究超聲靶向微泡介導CD133-shRNA轉染對CD

4、133+肝癌干細胞上皮間質轉化調控的分子機制。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)SMMC-7721肝癌細胞，通過流式分選CD133+SMMC-7721肝癌細胞，檢測分選前后CD133表達情況；通過成球試驗、CCK-8增殖實驗、成瘤實驗鑒定分選的肝癌干細胞；
　　2.將分選的CD133+SMMC-7721肝癌干細胞分為三組：對照組(Control)，質粒+脂質體組（P+L）；質粒+超聲輻照微泡組（P+UTMD）分別按條件進行轉染

5、，熒光顯微鏡觀察轉染后熒光表達情況，流式細胞術檢測轉染率，以及熒光定量PCR（qRT-PCR）、Western Blot方法檢測轉染后各組細胞CD133 mRNA和蛋白的表達。
　　3.通過qRT-PCR檢測轉染后各組肝癌細胞中干細胞相關基因CD44、CD90、Oct4、Sox2的表達情況；成球試驗檢測各組細胞的自我更新能力；CCK-8、克隆形成實驗檢測各組肝癌細胞增殖及克隆形成能力；利用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡的變化；Tran

6、swell侵襲及遷移實驗檢測細胞的侵襲及遷移能力的變化；構建裸鼠移植瘤模型，將轉染各組細胞注入隨機分組裸鼠皮下，觀察裸鼠移植瘤的生長情況。
　　4. qRT-PCR、Western blot檢測各組細胞中上皮細胞標志物（E-cadherin蛋白）和間葉細胞標志物（N-cadherin和vimentin蛋白）的表達情況，免疫組化檢測裸鼠瘤組織上述EMT標記物的表達情況；Western blot檢測NF-κB通路表達情況。
　　

7、結果：
　　1.利用流式分選技術成功從SMMC-7721肝癌細胞系中分選出CD133+肝癌干細胞。流式分選檢測結果顯示，分選前SMMC-7721肝癌細胞中的CD133+細胞比例為0.2-2％，分選后CD133+細胞的比例可達90%；CD133+肝癌干細胞在干細胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)條件下成團生長，數(shù)量變多，體積變大。成球實驗，CCK-8增殖實驗和裸鼠成瘤實驗表明，CD133+SMMC-7721肝癌干細胞有較高的成球能力、增殖能力及成

8、瘤能力。
　　2.熒光顯微鏡下觀察結果發(fā)現(xiàn)，CD133-shRNA轉染后，超聲微泡轉染組細胞與脂質體轉染組相比，有較強的熒光表達；流式細胞儀定量檢測各轉染組的轉染效率結果顯示，超聲微泡轉染組轉染效率高于脂質體轉染組（P＜0.05）；qRT-PCR和Western Blot結果顯示，超聲微泡轉染組CD133表達低于脂質體轉染組和對照組（P＜0.05）。
　　3. qRT-PCR結果顯示，超聲微泡轉染組細胞干細胞相關基因CD44

9、、CD90、Oct4、Sox2的mRNA水平低于脂質體轉染和對照組（P＜0.05）；成球實驗、CCK-8及細胞克隆形成實驗表明，超聲微泡組轉染細胞的自我更新能力、增殖及克隆形成能力低于脂質體轉染組和對照組（P<0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示，超聲微泡轉染組細胞的凋亡率增高（P<0.05）。Transwell實驗和裸鼠移植瘤實驗結果表明，超聲微泡轉染組細胞的遷移、侵襲能力及成瘤能力低于脂質體轉染和對照組（P<0.05)。
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10、. qRT-PCR、Western blot和免疫組化結果顯示，超聲微泡轉染組與脂質體轉染組及對照組相比，上皮細胞標志物E-cadherin蛋白升高，而間葉細胞標志物N-cadherin和vimentin蛋白表達降低（P<0.05)；另外，通過 Western Blot檢測了 NF-κB經(jīng)典通路 IKKβ/IκBα/RelA及p-IKKβ、p-IκBα、p-RelA蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)超聲靶向微泡介導CD133-shRNA轉染肝癌干細胞后p

11、-IKKβ、p-IκBα、p-RelA表達均降低（P<0.05)。
　　結論：
　　1. CD133+SMMC-7721細胞具有較強的成球、增殖能力及體內成瘤能力，是具有腫瘤干細胞特性的肝癌細胞亞群。
　　2.超聲靶向微泡破壞介導的CD133-shRNA轉染后能顯著下調CD133+肝癌干細胞CD133的表達，并抑制其增殖、侵襲及成瘤能力。
　　3.超聲靶向微泡破壞介導的CD133-shRNA轉染后CD133+肝癌