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文檔簡介
1、目的:研究粘著斑激酶(Focal adhesion kinase,F(xiàn)AK)通過整合素β1對肺成纖維細(xì)胞遷移影響的效果和機(jī)制。
方法:
1.細(xì)胞實驗
1.1、人肺成纖維細(xì)胞(Human Lung Fibroblasts,HLFs)從美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)購買。細(xì)胞在含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)、2mM/
2、L谷氨酰胺、100單位/ml青霉素、100單位/ml鏈霉素、100單位/ml慶大霉素的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)保存和傳代。培養(yǎng)至第7-9代用于實驗。細(xì)胞重懸于DMEM中,接種到纖維連接蛋白(Fibronectin,F(xiàn)N)包被的培養(yǎng)板中,按各組的實驗要求干預(yù)、培養(yǎng)、裂解細(xì)胞,收集全細(xì)胞裂解液備用,或者行細(xì)胞劃痕實驗。
1.2、免疫印跡實驗(West
3、ern blot,WB)檢測FAK的激活率,Western blot結(jié)合免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)實驗檢測整合素β1是否與FAK結(jié)合,細(xì)胞劃痕實驗測定HLFs在FN上的遷移功能。
2.動物實驗
2.1、8-11周齡C57BL/6小鼠分4組:正常對照組,PF-573228對照組,博萊霉素(Bleo)組,PF-573228干預(yù)組。小鼠被麻醉后,以Bleo(3 U/公斤體重,只小
4、鼠的劑量用生理鹽水配至50μl)或生理鹽水(50μl/只)緩慢經(jīng)氣管注射。隨后正常對照組和Bleo組每日經(jīng)腹腔注射0.2ml生理鹽水,PF-573228對照組和PF-573228干預(yù)組每日經(jīng)腹腔注射PF-573228(50mg/kg,每只小鼠的劑量用生理鹽水配至0.2ml)。21天后獲取小鼠肺組織,肺組織用于病理學(xué)、蛋白組學(xué)檢查及檢測全肺羥脯氨酸。
2.2、肺病理組織標(biāo)本HE(Hematoxylin-Eosin,HE)染色用于
5、阿什克羅夫特(Ashcroft)評分,全肺組織檢測羥脯氨酸含量,Western blot檢測FN、Ⅰ型前膠原蛋白(Procollagen TppeⅠ Protein,Pro-Col1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)評價肺纖維化的程度;Western blot檢測Rac、FAK的激活率和S100A4表達(dá),評價肺組織中肺成纖維細(xì)胞的遷移程度。
3.統(tǒng)計學(xué)方法
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)
6、準(zhǔn)差表示,并使用獨立樣本t檢驗或配對t檢驗統(tǒng)計分析(用于兩組間的比較)。細(xì)胞實驗重復(fù)三至四次,動物實驗每個實驗組或?qū)φ战M包含5到6只動物,重復(fù)兩次,p<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:
1.血小板衍生生長因子(Platelet-derived Growth Factor-BB,PDGF-BB)誘導(dǎo)HLFs過程中調(diào)節(jié)FAK激活及調(diào)節(jié)FAK與整合素β1結(jié)合的機(jī)制
PDGF-BB誘導(dǎo) FAK激活呈雙峰樣改變,第一
7、個是較低的峰值PDGF-BB的濃度在0.1-0.5 ng/ml的范圍,第二個是最高峰值PDGF-BB的濃度在1-5 ng/ml的范圍。給予2ng/mlPDGF-BB誘導(dǎo)HLFs時,F(xiàn)AK激活最早發(fā)生在誘導(dǎo)后的6分鐘。FAK早期有一定幅度的激活發(fā)生在PDGF-BB誘導(dǎo)后的30分鐘。隨后FAK激活有下降趨勢,但于PDGF-BB誘導(dǎo)后5小時FAK激活再逐步增加,并于PDGF-BB誘導(dǎo)后20小時達(dá)到頂峰。PDGF-BB以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)HL
8、Fs遷移。在HLFs培養(yǎng)過程中,如果沒有PDGF-BB的誘導(dǎo)FAK與整合素β1無關(guān)聯(lián)(圖2-7)。在PDGF-BB誘導(dǎo)下,F(xiàn)AK與整合素β1直接結(jié)合,這種結(jié)合在PDGF-BB誘導(dǎo)10個小時達(dá)到高峰。
2.FAK抑制劑對PDGF-BB誘導(dǎo)HLFs遷移,及對FAK與整合素β1結(jié)合的影響
PDGF-BB誘導(dǎo)遷移率(每24小時傷口覆蓋區(qū)域)與其被使用的劑量呈正相關(guān),誘導(dǎo)遷移率最高的PDGF-BB范圍為1-5 ng/ml。PD
9、GF-BB誘導(dǎo)HLFs遷移也是時間依賴的方式。PDGF誘導(dǎo)5個小時和24小時后遷移率分別顯著增加(P<0.01)。PF-573228抑制PDGF-BB誘導(dǎo) FAK激活(pY397 of FAK)和抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的HLFs遷移的劑量依賴性的方式。給予FAK抑制劑并沒有阻止FAK與整合素β1結(jié)合,PF-573228即使在能有效地抑制PDGF-BB誘導(dǎo)FAK激活和HLFs遷移的劑量(1或5μM)下仍沒有影響FAK-整合素β1結(jié)。
10、> 3.整合素β1在FAK激活和FAK調(diào)控HLFs遷移中的功能
與對照免疫球蛋白組相比,整合素β1抑制性抗體減少約85%的遷移(p<0.001)。整合素α5或α4抑制性抗體抑制約50%的HLFs在FN上遷移。阻斷整合素α vβ3、α vβ6或α vβ8,各抑制HLFs在FN上約5%的遷移。整合素β1抑制性抗體明顯阻斷PDGF-BB-誘導(dǎo)的 FAK的激活。當(dāng)HLFs接種到FN上沒有PDGF-BB誘導(dǎo)時,整合素β1抑制性抗體或?qū)?/p>
11、照免疫球蛋白G組沒有影響FAK基本的激活。整合素β1阻斷抗體中斷了PDGF-BB誘導(dǎo)HLFs中FAK與整合素β1聯(lián)系。
4.FAK抑制劑PF-573228對博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的干預(yù)效果及機(jī)制研究肺組織的形態(tài)學(xué)分析揭示FAK抑制劑干預(yù)組與Bleo組相比Ashcroft肺纖維化評分大約下降1.2分(p<0.01)。檢測羥脯氨酸替代總膠原蛋白在整個肺組織含量,F(xiàn)AK抑制劑干預(yù)組較 Bleo組總膠原蛋白水平顯著降低(p<0.01
12、)。FAK抑制劑干預(yù)組與Bleo組相比,F(xiàn)AK抑制劑顯著抑制FAK和Rac激活,和顯著降低S100A4表達(dá),顯著降低整個肺FN和Pro-Col1含量,顯著降低肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)。
結(jié)論:
1.PDGF-BB以劑量依賴和時間依賴的方式激活FAK,并且使FAK被招募后直接與整合素β1結(jié)合。
2.FAK抑制劑PF-573228以劑量依賴和時間依賴的方式抑制PDGF-BB誘導(dǎo)FAK的激活,并可能通
13、過此機(jī)制抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的HLFs遷移。FAK與整合素β1相結(jié)合可能為FAK激活的上游信號。
3.整合素β1在PDGF-BB誘導(dǎo)人肺HLFs遷移過程中發(fā)揮主要作用,整合素β1粘附在FN上對FAK和整合素β1結(jié)合,以及對隨后PDGF-BB誘導(dǎo)FAK的激活都是必不可少的。
4.FAK抑制劑通過抑制HLFs的遷移、抑制細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)蛋白質(zhì)產(chǎn)生、抑制肌HLFs的分化,從而
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