Apelin對LPS誘導大鼠急性肺損傷的保護作用及機制.pdf

1、當呼吸道或機體感染細菌、病毒及其他刺激物如脂多糖(LPS)等病原抗原成分和代謝產物時，可以誘導急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的發(fā)生發(fā)展，若病情惡化可以很快發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distresssyndrome，ARDS)，以進行性呼吸窘迫與低氧血癥為臨床表現(xiàn)，是臨床常見的急危重癥，預后極差。ALI/ARDS發(fā)病機制極其復雜，其中炎癥反應與氧化應激是其主要的機制之一。

2、>　　近年來，生物小分子活性肽在機體自穩(wěn)態(tài)中的調節(jié)作用的研究受到廣泛重視。Apelin是一種新型的小分子活性肽，Apelin及其受體APJ組織分布廣泛，通過內分泌、旁/自分泌的方式維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮廣泛的生物學效應。已有研究表明Apelin作為重要的生理調節(jié)肽，能夠調節(jié)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)、促進水鹽平衡，提示Apelin在維持肺循環(huán)穩(wěn)態(tài)、肺部疾病發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的重要效應，但Apelin在ALI中的作用及其機制仍有待研究。
　　

3、研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激增強是誘導ALI的原因之一，核因子2(Nrf2)作為氧化應激過程中非常關鍵的轉錄因子，被證實在氧化應激反應中能夠發(fā)揮抗炎及抗氧化功能，促進機體損傷修復，其調控機體對抗外來刺激及氧化損傷的重要作用已經在多種免疫系統(tǒng)疾病中得到了證實，但在LPS誘導的ALI中具體保護機制仍有待探討。核轉錄因子κB(NF-κB)是機體炎癥、應激反應的主要調節(jié)器，受到外來刺激時易被活化轉位入核，從而導致一系列炎癥反應的發(fā)生，其在肺部炎癥疾病中的

4、重要病理作用已深入研究，但其與保護因子Nrf2在LPS誘導的ALI中的相互作用卻不清楚。
　　基于上述研究背景，我們推測Apelin可能參與了LPS誘導的ALI的調節(jié)，這種調節(jié)可能是通過促進Nrf2的抗氧化應激反應，抑制NF-κB誘導的炎癥反應來實現(xiàn)的。為驗證這一實驗性假設，本課題以Nrf2/NF-κB在LPS誘導ALI中的作用及Apelin調節(jié)機制為切入點，擬通過使用LPS作為炎癥刺激劑制備大鼠急性肺損傷模型，首先觀察了肺組織病

5、理學改變，分析了TNF-α等炎癥因子、肺組織干濕重比(W/D)及肺泡灌洗液中細胞數(shù)量的變化。其次，檢測了肺組織相關氧化產物含量及抗氧化酶活性，以及NF-κB、Nrf2等蛋白表達水平。實驗方法及結果如下:
　　1.LPS誘導的大鼠ALI模型建立:選取成年雄性SD大鼠（250g左右）32只，隨機均分為4組，分別為Control組、LPS組、LPS+Apelin組、Control+Apelin組，其中LPS組和LPS+Apelin組于大

6、鼠氣管緩慢滴注LPS(5mg/kg)，Control組、Control+Apelin組氣管滴注同等劑量的生理鹽水，LPS+Apelin組與Control+Apelin組在LPS滴注4小時后腹腔注射apelin(10nmol/kg)，以后每間隔6h注射一次，LPS注射24h后，收集大鼠血漿、肺組織、肺泡灌洗液等樣本，通過HE染色法觀察肺組織病理改變，結果顯示LPS組肺泡壁毛細血管充血嚴重，細支氣管腔內有較多脫落炎性細胞及滲出物。LPS+A

7、pelin組與LPS組呈現(xiàn)相似的病理組織學變化，但相應損傷程度明顯減輕;通過檢測支氣管肺泡灌洗液中細胞計數(shù)、蛋白含量觀察毛細血管的滲漏情況，LPS組細胞計數(shù)、蛋白含量、中性粒細胞占細胞總數(shù)百分率、單核細胞占細胞總數(shù)百分率均顯著增加，肺泡吞噬細胞占細胞總數(shù)百分比均顯著下降(p＜0.01);右肺稱重記錄肺濕/干重比(W/D)，LPS組顯著高于Control組，LPS+Apelin組顯著低于LPS組(p均＜0.05）;血氣分析評估機體酸堿平衡

8、失調情況及缺氧程度以輔助判斷急性肺損傷情況，結果表明，LPS組的PaO2值降低而PaCO2數(shù)值上升， LPS+Apelin組PaO2值顯著高于LPS組(p＜0.05)。這些結果表明，LPS誘導的大鼠ALI模型制備成功，Apelin對LPS誘導的ALI具有保護作用。
　　2.采用Elisa方法測定肺組織及肺泡灌洗液中TNF-α MCP-1等炎癥因子水平，結果顯示LPS組大鼠肺組織及肺泡灌洗液中TNF-α、MCP-1等炎癥因子明顯增加

9、，LPS+Apelin組炎癥因子水平顯著緩解(p＜0.05）。采用Western Blot技術測定大鼠肺組織中Nrf2、NOD2、CAMKII、NF-κB p65、p-ERK蛋白表達。結果表明，LPS組肺組織NOD2、CAMKII、p-ERK蛋白表達水平顯著高于Control組，LPS+Apelin組相關蛋白表達水平低于LPS組(p＜0.05），LPS組肺組織胞核中Nrf2、NF-κB p65蛋白表達均高于Control組，LPS+Ap

10、elin組Nrf2胞核蛋白表達高于LPS組，NF-κB p65蛋白表達低于LPS組。這些結果表明，Apelin能增強Nrf2抗氧化活性，抑制NF-κB表達從而減緩ALI的嚴重程度。
　　3.采用TBA法等測定肺組織中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、羥自由基(·OH)等氧化產物及氧自由基含量。結果表明，LPS組·OH、NO、MDA含量顯著高于LPS+Apelin組(p均＜0.05）;采用微量酶標法等檢測谷胱甘肽過氧化物酶(GSH

11、-PX)、過氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、髓過氧化物酶(MPO)、乳酸脫氫酶(LDH)等抗氧化酶、損傷相關酶活力變化。結果表明，LPS組肺組織GSH-PX、CAT、SOD酶活力顯著低于LPS+Apelin組(p＜0.05)，損傷相關酶LDH、MPO酶活力顯著高于LPS+Apelin組。這些結果表明，氧化應激反應參與了LPS誘導的ALI進程，Apelin能夠一定程度減緩氧化產物的生成，增強抗氧化酶活性。
　　綜上所述