sFRP5甲基化在硫酸吲哚酚誘導腎纖維化中的作用研究.pdf

1、腎纖維化是各種慢性腎臟病(Chronic Kideney Disease，CKD)發(fā)展為終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的主要病理基礎。腎纖維化以間質纖維化和腎小管擴張為特征，其嚴重程度與腎功能受損情況及患者腎臟疾病的預后有著非常密切的關系。截止目前，腎纖維化的發(fā)生機制并未完全闡明，因此，對該病理過程的深入研究具有非常重要的臨床意義。
　　腎纖維化的發(fā)生與發(fā)展與多種因素有關，如炎癥、氧化應激等

2、，這些因素會導致腎臟固有細胞致纖維化因子分泌，造成腎小管上皮細胞轉分化(EMT)及成纖維細胞增殖與活化，最終導致腎纖維化。而尿毒癥毒素蓄積是CKD患者另一重要的臨床特征，近年來，人們開始關注尿毒癥毒素在CKD及其并發(fā)癥中的作用，特別是蛋白結合毒素，如硫酸吲哚酚(IS)，對甲酚硫酸鹽(PCS)，由于它們不能通過常規(guī)透析有效清除，可以在血液循環(huán)中長時間大量存在，對機體產(chǎn)生不良影響。晚近，我們和其他學者的研究均發(fā)現(xiàn)蛋白結合毒素IS可以促進腎纖

3、維化，但截至目前，相關機制并未進行深入研究。
　　Wnt/β-catenin信號通路活化是導致腎纖維化的關鍵途徑之一。在正常機體中，Wnt/β-catenin信號通路處于沉默狀態(tài)，而腎臟損傷后，該通路被激活，使大量β-catenin進入細胞核內并與TCF/LEF形成β-catenin/TCF/LEF復合物，從而激活下游靶基因的轉錄，如纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)，纖連蛋白，成纖維細胞特異性蛋白1(FSP1)，Snail1

4、，MMP-7等，最終導致腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展。而在IS誘導腎纖維化的過程中Wnt信號通路是否參與其中并不明確。既往研究表明，Wnt信號通路活化與否與其內源性抑制因子有關，Wnt信號通路的內源性抑制因子包括分泌型卷曲蛋白家族(secreatedfrizzled-related proteins，sFRPs)和清道夫受體家族(Diekkopfs，DKKs)。其中，sFRPs家族有5個成員，即sFRP1-5，sFRPs蛋白N-端的卷曲樣半胱氨

5、酸富集區(qū)域與Wnt特異性Frizzlrd受體有30％-50％序列相似，它可通過該區(qū)域與Wnt結合，或與Frizzlrd受體相互作用形成無功能的復合物，從而封閉Wnt信號通路。而sFRPs表達降低可引起Wnt信號通路持續(xù)激活，導致β-catenin在胞內大量蓄積，進而激活Wnt信號的下游靶基因。眾所周知，Wnt信號通路活化可以促進癌細胞增殖，而sFRPs啟動子甲基化后的表達下調正是造成Wnt信號通路活化和癌癥進展的重要機制之一。而引入關注

6、的是，在尿毒癥特有的內環(huán)境下，蛋白結合毒素可以通過多種表觀遺傳修飾方式調節(jié)基因表達，DNA甲基化就是其中非常重要的一種表觀遺傳修飾方式，并且，有研究證實IS確實可以誘導某些基因發(fā)生甲基化。為此，我們將在本研究中明確IS促進腎纖維化的作用是否與其誘導Wnt/β-catenin信號通路活化有關，并闡明sFRPs基因甲基化在此過程中是否發(fā)揮了關鍵作用，并探討其中的可能機制，以期深入揭示腎纖維化的發(fā)生機理并為其防治提供新的干預靶點。
　　

7、為此，本研究首先觀察了CKD患者腎纖維化程度，IS血清濃度以及β-catenin表達之間的相關性;然后以人腎近曲小管上皮細胞（HK-2細胞）為體外研究對象，探討IS誘導HK-2細胞Wnt/β-catenin信號通路激活的作用，并明確IS是否通過誘導sFRPs基因甲基化活化Wntβcatenin信號通路;最后，利用CD-1小鼠制備單側腎切除模型，觀察腹腔注射甲基化轉移酶抑制劑5Aza-2dc或sFRPs重組蛋白對小鼠腎纖維化的影響，明確外

8、源性補充sFRPs重組蛋白和甲基化轉移酶抑制劑是否可以減輕IS誘導的腎間質纖維化。
　　主要研究內容及研究結果如下:
　　1.CKD患者血清IS濃度與腎臟β-catenin表達，腎間質纖維化程度呈正相關關系;
　　34例患者的eGFR與血清IS濃度、β-catenin表達和腎間質纖維化程度呈顯著負相關，即患者的eGFR越低，血清IS濃度和β-catenin的表達越高，腎間質纖維化越重;相反，34例患者的血清IS濃度與β

9、-catenin表達、腎纖維化程度呈顯著正相關;提示患者血清IS濃度與β-catenin表達和腎間質纖維化程度有著密切關聯(lián)。
　　2.在單側腎切除CKD模型小鼠中，腹腔注射IS能夠誘導腎間質纖維化并激活Wnt/β-catenin信號通路;
　　IS注射組小鼠血清IS濃度較對照組小鼠血清IS濃度增高5倍;Masson染色顯示，與對照組相比，IS注射組小鼠腎間質膠原沉積明顯增加;免疫組化和westem blot結果表明，與對照組

10、相比，IS注射組小鼠β-catenin和α-SMA表達顯著增加。上述結果表明，腹腔注射IS可以誘導單側腎切除小鼠腎間質纖維化，該作用可能與其激活Wnt/β-catenin信號通路有關。
　　3.IS通過下調sFRP5表達激活Wnt/β-catenin信號通路;
　　IS對sFRP3和sFRP4 mRNA表達無明顯影響，sFRP1和sFRP2在HK-2細胞表達極弱，但sFRP5 mRNA表達隨著IS濃度的增加呈劑量依賴性降低;

11、western blot結果同樣表明，IS劑量依賴性的下調sFRP5表達。這說明IS可能通過抑制sFRP5表達激活了HK-2細胞Wnt/β-catenin信號通路。為了進一步明確上述結論，我們在CKD患者腎活檢組織和腹腔注射IS的單側腎切除小鼠腎組織中觀察了sFRP5的表達情況，免疫組化染色結果表明，CKD5期患者腎臟sFRP5表達較正常腎臟組織明顯減弱。免疫組化、RT-PCR和western blot檢測發(fā)現(xiàn)腹腔注射IS的CKD小鼠腎

12、臟sFRP5 mRNA和蛋白表達較對照組明顯減弱。上述結果充分證實，IS通過下調sFRP5表達誘導了Wnt/β-catenin信號活化。
　　4.IS通過誘導sFRP5 DNA甲基化下調了sFRP5表達，導致了Wnt/β-catenin信號通路活化;
　　5.IS通過激活ROS/ERK1/2信號通路誘導sFRP5 DNA甲基化;
　　眾所周知，IS能夠促進多種細胞發(fā)生氧化應激，而氧化應激是DNA啟動子CpG島發(fā)生甲基化

13、的一個主要誘發(fā)因素。為此，我們探討了IS是否是通過誘導氧化應激并激活下游信號通路發(fā)揮致sFRP5 DNA甲基化的作用。DCFH-DA檢測結果發(fā)現(xiàn)，IS可呈時間和劑量依賴性促進HK-2細胞內ROS生成;western blot結果顯示，IS劑量依賴性的誘導p-ERK1/2表達增高。而5 mM ROS清除劑NAC和10μM ERK1/2抑制劑U0126預孵育HK-2細胞1h，均可明顯抑制IS誘導的p-ERK1/2表達增高和sFRP5 DNA

14、啟動子甲基化。此外，NAC和U0126預孵育均能顯著抑制IS誘導的DNMT1蛋白表達增加和sFRP5蛋白表達下降。以上結果提示IS通過激活ROS/ERK1/2信號通路，導致DNMT1表達增加，進而誘導了sFRP5 DNA甲基化，從而下調了HK-2細胞sFRP5的表達。
　　6.外源性補充5Aza-2dc能夠明顯抑制IS誘導的CKD模型小鼠腎組織sFRP5 DNA甲基化程度及sFRP5表達下調;
　　建立單側腎切除CKD小鼠模

15、型，腹腔注射IS的同時注射5Aza-2dc(0.35mg/kg/48h)，MSP檢測各組小鼠sFRP5 DNA甲基化程度，結果發(fā)現(xiàn)，5Aza-2dc能夠顯著降低IS誘導的腎組織sFRP5 DNA甲基化程度。RT-PCR、免疫組化和western blot檢測結果顯示，5 Aza-2dc能夠抑制IS誘導的sFRP5表達下調。因此，我們的體內研究進一步證實，IS可以誘導sFRP5 DNA甲基化，而sFRP5 DNA啟動子甲基化很可能是IS誘

16、導腎間質纖維化的關鍵機制。
　　7.腹腔注射sFRP5重組蛋白和5Aza-2dc明顯抑制了IS誘導Wnt/β-catenin信號通路活化及腎間質纖維化。
　　為了明確sFRP5 DNA啟動子甲基化在IS誘導Wnt/β-eatenin信號通路活化和腎間質纖維化中的作用，我們在給予CKD模型小鼠腹腔注射IS的同時注射不同濃度的sFRP5重組蛋白(0.02mg/kg/48h，0.01 mg/kg/48h)或5Aza-2dc(0.3

17、5 mg/kg/48h)，觀察Wnt/β-catenin信號通路的活化情況和腎纖維化程度。Masson染色結果表明，外源性補充sFRP5重組蛋白或5Aza-2dc均可不同程度的減輕IS誘導的模型小鼠腎間質膠原沉積，免疫組化和western blot檢測發(fā)現(xiàn)纖維化標志物α-SMA表達也明顯降低。此外，外源性補充sFRP5重組蛋白或5Aza-2dc均可顯著抑制IS誘導的β-catenin表達增高。我們分析認為，外源性補充sFRP5重組蛋白或

18、者抑制sFRP5 DNA啟動子甲基化均可削弱IS誘導的Wnt/β-catenin信號活化，改善腎間質纖維化。因此，sFRP5啟動子甲基化是IS誘導腎間質纖維化的關鍵環(huán)節(jié)。
　　綜上所述，本研究表明，IS通過激活ROS/ERK1/2信號通路，誘導了sFRP5 DNA啟動子甲基化，導致sFRP5表達下調，進而活化Wnt/β-catenin信號，最終促進了腎間質纖維化的發(fā)生、發(fā)展。而外源性補充sFRP5重組蛋白或者使用甲基化轉移酶抑制劑