博卡病毒MVC結構蛋白VP2多克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、目的：犬博卡病毒MVC（Minute Virus of canine）是細小病毒家族博卡病毒亞家族的成員之一。而VP2作為MVC病毒的結構蛋白，不僅是構成衣殼蛋白的主要成分，更是細小病毒的主要免疫原性抗原，其具有凝血活性的物質，是作為決定宿主范圍以及宿主與病毒之間相互作用的關鍵影響因素。因此，本文通過構建MVC的VP2結構蛋白的原核表達載體，通過誘導表達、純化目的蛋白，免疫兔子、制備針對VP2的多克隆抗體，為進一步研究VP2在MVC病毒

2、致病及感染中的作用，深入揭示MVC病毒致病及感染的分子機制奠定研究基礎。
　　方法：(1)以本實驗室保存的博卡病毒MVC的感染性克隆載體pIMVC為模板PCR擴增VP2基因，并將其產物純化。將純化產物與表達載體pET32a(+)經EcorⅠ、XhoⅠ同時雙酶切，經T4連接酶連接，轉化到克隆菌株Ecoli.DH5α以及表達菌株Ecoli.BL21，通過雙酶切鑒定正確后,進行IPTG誘導表達，SDS-PAGE檢測和鑒定目的蛋白的表達。

3、目標蛋白經大量表達后，回收細菌超聲裂解并Ni柱純化，以純化產物作為完全抗原免疫新西蘭大白兔。(2)ELISA檢測抗體效價。(3)以MVC感染WRD（Walter Reed Dog）嗜性細胞，然后運用Western blot和免疫熒光技術鑒定抗體特異性。
　　結果：(1)DNA序列測定及雙酶切鑒定結果均顯示MVC-VP2基因成功構建至原核表達載體pET32a(+)上，原核表達產物經SDS-PAGE鑒定后證實成功表達一相對分子量（Mr

4、）約為39kd的目的蛋白條帶，VP2目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。
　　(2)以純化得到的MVC-VP2重組蛋白免疫制備得到兔血清，ELISA方法測得其效價為1：200000。
　　（3）Western blot、免疫熒光方法證實VP2多抗血清能夠成功檢測MVC感染的WRD細胞，并且具有特性。
　　結論：成功構建了MVC結構蛋白基因VP2的原核表達載體pET32a(+)-VP2，并表達了相應的可溶性蛋白。制備了高效