GRP75通過影響線粒體功能激活ROS-JNK-IRS信號通路參與細胞胰島素敏感性的調節(jié).pdf

1、GRP75(Glucose-Regulated Protein75)蛋白屬于熱休克蛋白mtHsp70家族成員，主要定位于線粒體基質中還有一部分GRP75蛋白位于細胞質基質以及細胞質基質的囊泡中。GRP75蛋白能夠協(xié)助約有20％線粒體內(nèi)的蛋白進入到線粒體中，幫助進入線粒體內(nèi)的未折疊蛋白折疊成正確的構象，同時GRP75蛋白還能夠協(xié)助錯誤蛋白折疊成形成正確的蛋白構象以及損傷蛋白的降解?，F(xiàn)階段對于GRP75蛋白的研究主要集中在GRP75蛋白與細

2、胞的抗應激反應上的功能研究，但是對于GRP75蛋白與代謝性疾病尤其是細胞胰島素抵抗之間的關系研究現(xiàn)在還是空白狀態(tài)。因而，研究GRP75蛋白是如何參與細胞產(chǎn)生胰島素抵抗的機制有著十分重要的意義。通過高脂喂養(yǎng)制造的胰島素抵抗的小鼠模型中我們發(fā)現(xiàn)在小鼠的肝臟和脂肪細胞中GRP75蛋白的表達量呈下降趨勢，通過這個結果可以初步看出GRP75蛋白與胰島素抵抗之間存在著一定的關系。在3T3-L1及C2C12細胞中構建了GRP75KD(Knock Do

3、wn)的細胞模型之后對其進行功能的檢測，發(fā)現(xiàn)GRP75KD的細胞產(chǎn)生了胰島素抵抗的現(xiàn)象。這進一步證實了GRP75蛋白與細胞產(chǎn)生胰島素抵抗之間存在著直接的關系。
　　目的:
　　1.通過對胰島素抵抗小鼠細胞模型中的肝臟和脂肪及骨骼肌組織進行WB(Western Blot)檢測，檢測脂肪組織和肝臟組織中GRP75蛋白的表達量。
　　2.使用RNAi(RNA interference)技術，對3T3-L1和C2C12細胞系進

4、行GRP75蛋白進行穩(wěn)定敲低，構建穩(wěn)定的GRP75KD細胞模型。
　　3.檢測GRP75KD細胞對胰島素刺激下的葡萄糖吸收水平。
　　4.對GRP75KD細胞進行線粒體功能檢測，主要檢測:線粒體ATP生成能力、膜電位水平、ROS(Reactive Oxygen Species)水平，確定GRP75蛋白是否影響線粒體的功能。
　　5.對GRP75KD細胞胰島素信號通路進行檢測，主要檢測AKT蛋白的Ser437位點和Thr

5、308位點的磷酸化水平，以及IRS1(Insulin Receptor Substrate1)Ser302和Ser307位點磷酸化水平檢測，確定GRP75蛋白敲低之后對胰島素信號通路的影響。
　　6.對GRP75KD細胞中JNK蛋白的磷酸化水平檢測，確定GRP75蛋白敲低之后能否提高JNK蛋白的磷酸化水平。
　　7.對GRP75KD細胞加入NAC(N-acetyl-L-Cysteine)后，檢測細胞的胰島素信號通路是否得到恢

6、復，JNK蛋白磷酸化水平是否降低。
　　方法:
　　1.使用life technology公司的RNAi功能模塊設計了一條shRNA，通過查找文獻確定另外一條shRNA。使用兩條shRNA對3T3-L1和C2C12兩株細胞進行RNAi。使用嘌呤霉素進行篩選獲得多個GRP75成功敲低的細胞克隆。
　　2.將GRP75KD細胞培養(yǎng)至覆蓋度達到80％之后，檢測胰島素刺激下的葡萄糖吸收水平在對照組及GRP75KD細胞之間的差異

7、。
　　3.將GRP75KD細胞培養(yǎng)至覆蓋度達到80％時進行線粒體功能的檢測，分析GRP75敲低之后線粒體功能與正常對照之間的差異性。
　　1)應用TMRM熒光染料檢測GRP75KD細胞的膜電位水平。
　　2)應用ATP檢測試劑盒分析GRP75KD細胞內(nèi)以及線粒體內(nèi)的ATP生成能力
　　3)應用ROS檢測試劑盒GRP75KD細胞線粒體內(nèi)ROS水平
　　4)應用DCFH-DA試劑盒檢測GRP75KD細胞內(nèi)整體

8、ROS水平。
　　4.對GRP75KD細胞中的胰島素信號通路蛋白進行檢測，主要檢測胰島素信號通路中的AKT蛋白Ser437位點和Thr308位點的磷酸化水平以及IRS1蛋白Ser302和Ser307位點磷酸化水平檢測。
　　5.對GRP75蛋白敲低后的細胞的JNK蛋白磷酸化水平的檢測，通過WB技術檢測確定在GRP75KD細胞與正常對照細胞之間是否存在差異。
　　6.通過在GRP75KD細胞中加入NAC(N-乙酰半胱氨酸

9、)后，檢測JNK蛋白的磷酸化水平，AKT蛋白以及IRS1蛋白相應位點的磷酸化水平是否發(fā)生變化。
　　結果和結論:
　　1.高脂喂養(yǎng)的胰島素抵抗小鼠的肝臟和白色脂肪組織中，GRP75蛋白在肝臟組織和肌肉組織中表達量具有顯著性的降低。同時IRS1蛋白Ser302位點磷酸化水平降低。
　　2.GRP75KD的3T3-L1細胞和C2C12細胞，胰島素刺激下的葡萄糖吸收在 GRP75KD的細胞中較正常細胞有顯著性的降低。

10、　　3.GRP75KD的3T3-L1細胞和C2C12細胞，細胞內(nèi)整體的ROS以及線粒體內(nèi)的ROS水平較對照細胞有顯著性的差異。
　　4.GRP75KD的3T3-L1細胞和C2C12細胞，線粒體的膜電位水平、ATP生成能力均有顯著性的下降。
　　5.GRP75KD的3T3-L1細胞和C2C12細胞中，JNK(c-Jun N-terminal Kinase)蛋白的磷酸化水平增加，說明JNK蛋白在GRP75蛋白敲低之后JNK蛋白被

11、活化。
　　6.GRP75KD的3T3-L1細胞和C2C12細胞中，AKT蛋白的Ser437位點和Thr308位點的磷酸化水平水平降低。
　　7.GRP75KD的3T3-L1細胞和C2C12細胞中，IRS1蛋白的Ser302位點的磷酸化水平降低，Ser307位點的磷酸化水平增加。
　　8.通過對GRP75KD的3T3-L1細胞和C2C12細胞中加入NAC之后，JNK蛋白的磷酸化水平降低。
　　9.通過對GRP75

12、KD的3T3-L1細胞和C2C12細胞中加入NAC之后，AKT蛋白的Ser437位點和Thr308位點的磷酸化水平得到了一定程度的回復。
　　10.通過對GRP75KD的3T3-L1細胞和C2C12細胞中加入NAC之后IRS1蛋白的Ser302位點的磷酸化水平得到一定程度的回復，Ser307位點的磷酸化水平降低。
　　11.通過對GRP75KD的3T3-L1細胞和C2C12細胞中加入NAC之后，胰島素刺激下的葡萄糖吸收在對照