基于DIP病毒的腫瘤相關γ皰疹病毒-宿主拮抗機制研究.pdf

1、目的：
　　人類γ皰疹病毒與一些惡性腫瘤的發(fā)生密切相關，如EBV與Burkitt's淋巴瘤、霍奇金病、鼻咽癌(NPC)等相關，HHV-8/KSHV與卡波西肉瘤(KS)（AIDS病人中最常見的腫瘤）、原發(fā)性滲出性淋巴瘤(PEL)和多灶性卡斯特萊曼病(MCD)等相關。γ皰疹病毒感染宿主后，經過急性裂解復制階段，可以快速被宿主清除但能通過多種免疫逃逸策略在宿主中建立潛伏感染，并終身存在宿主體內。潛伏感染及免疫逃逸的存在使得被感染細胞容易

2、轉化，與惡性腫瘤形成密切相關。
　　EBV和KSHV為種屬特異性病毒，僅能感染人類和一些靈長類動物，且無法建立有效的細胞感染模型。鼠皰疹病毒68(murine herpesvirus68，MHV-68)是從野生倉鼠中分離得到的一種γ皰疹病毒，與人類γ皰疹病毒高度同源，并可感染小鼠等模式動物。因此，成為人類研究γ皰疹病毒與其宿主相互作用及探究各種γ皰疹病毒疫苗有效性的很有價值的模型。
　　RTA（replication and

3、 transcription activator，復制和轉錄活化位點）是調節(jié)皰疹病毒從潛伏期進入裂解復制的一個關鍵即刻早期基因產物。RTA在γ皰疹病毒中是保守的。RTA的表達可活化裂解復制相關基因，打破病毒潛伏狀態(tài)，促使病毒進入裂解復制。RTA的持續(xù)表達則可抑制病毒建立潛伏感染。已知，在MHV-68基因組中，ORF73的產物可抑制RTA的表達和功能，敲除ORF73的病毒其潛伏感染能力下降。ORF72、M11和ORF74位于ORF73附近

4、，這些基因在病毒的潛伏期進行轉錄，與病毒的潛伏感染及致瘤性密切相關。
　　與其他腫瘤相關皰疹病毒一樣，MHV-68存在多種免疫逃逸機制來抑制宿主的天然免疫和適應性免疫。其ORF10、11、36、54可以抑制Ⅰ型干擾素產生或者發(fā)揮作用，其M3基因具有泛素連接酶功能，能降低MHCⅠ類分子在感染細胞表面的表達，去除這些基因可提高宿主對病毒的識別及殺傷。
　　基于以上認識，我們在MHV-68背景基礎上構建了DIP(deficient

5、 in immuneevasion and persistence)重組病毒，該病毒去除了ORF10、11、36、54、 M3等抑制宿主免疫反應的基因以及ORF72、73、74、M11等潛伏期相關基因并持續(xù)活化復制和轉錄激活蛋白(RTA)。小鼠接種試驗表明DIP不會建立潛伏感染、并提供免疫保護作用。因此，將DIP作為一個“工具病毒”，研究該病毒的生物學特征及其刺激宿主所產生的免疫應答，將有組于我們理解機體抗病毒免疫調控機制，并加深我們對

6、γ皰疹病毒潛伏感染和免疫逃逸的認識。
　　本文的研究目的是通過對DIP病毒體內復制特性和誘導的宿主免疫反應的研究，尋找宿主調控病毒潛伏感染和免疫逃逸的可能機制。我們發(fā)現(xiàn)DIP MHV-68感染可以誘導產生大量的IFN-γ。因此我們進一步明確了IFN-γ對MHV-68裂解復制的作用和MHV-68抗IFN-γ的效應及Ⅰ型干擾素在IFN-γ抗MHV-68感染過程中所起的作用。
　　方法和結果：
　　本文的第一部分我們對構建的

7、DIP MHV-68在體內的復制特性及宿主的免疫應答進行了研究。通過建立體內感染模型:BALB/c小鼠經鼻感染DIP MHV-68或者野生病毒，分別于感染后3天、6天和14天，收集肺組織或脾組織，通過plaque assay或者infectious center assay檢測病毒的裂解復制和潛伏感染情況，結果發(fā)現(xiàn)DIP無法在體內建立裂解復制和潛伏感染。RT-qPCR動態(tài)的檢測病毒基因和細胞炎癥因子、干擾素相關因子和一些細胞因子的表達，

8、發(fā)現(xiàn)DIP病毒感染后，病毒基因轉錄水平迅速升高，感染后第3天達到高峰，而后開始下降，于第6天降至較低的水平。而IFN-γ的表達量在第6天明顯高于野生病毒，炎癥因子IL-1β和TNF-α感染后第1天即達高峰，而后逐漸下降，至第6天與野生病毒相似。ELISA結果顯示DIP感染后第6天小鼠血清和肺泡灌洗液中IFN-γ分泌量明顯增高。以上研究結果提示我們，IFN-γ在MHV-68感染免疫中發(fā)揮了重要的作用，后面的研究內容集中于IFN-γ與MHV

9、-68的相互作用展開。
　　本文的第二部分我們對IFN-γ在MHV-68裂解復制中的效應進行了研究。首先我們將野生MHV-68經鼻感染WT和IFN-γR-/-小鼠，plaque assay和DNAPCR分別檢測病毒滴度和DNA拷貝數(shù)，結果顯示WT和IFN-γ R-/-小鼠之間沒有明顯的差別，病毒腹腔感染小鼠也出現(xiàn)同樣的結果。通過RT-qPCR和ELISA檢測野生病毒感染C57BL/6和BALB/c小鼠后IFN-γ的表達和分泌情況，

10、發(fā)現(xiàn)均產生極低的IFN-γ。而腹腔注射IFN-γ可以抑制腹腔感染病毒的復制。IFN-γ預處理BMM、RAW264.7、MEF、NIH3T3和MLE-12細胞可顯著抑制MHV-68在這些細胞的復制，表現(xiàn)為病毒滴度下降、DNA拷貝數(shù)下降、ORF50表達下降。提取IFN-γ R-/-小鼠的BMM細胞和PM細胞檢測IFN-γ的抗病毒作用，發(fā)現(xiàn)IFN-γ抑制MHV-68的復制作用依賴IFN-γ受體的完整性。
　　本文的第三部分對Ⅰ型干擾素與

11、Ⅱ干擾素交互作用對IFN-γ抗病毒作用的影響及其機制進行了研究。通過RT-qPCR和ELISA，我們發(fā)現(xiàn)IFN-γ預處理的BMM細胞感染MHV-68后可以誘導Ⅰ型干擾素的表達和分泌。通過中和抗體抑制IFN-α明確分泌的IFN-α具有抑制MHV-68復制的活性。RT-qPCR結果顯示IFN-γ可以誘導Ⅰ型干擾素下游ISGs的表達，包括MX1和IRF7。通過RT-qPCR檢測IFN-γ對Toll樣受體的調節(jié)作用顯示IFN-γ可以上調BMM細

12、胞上TLR9的表達，且上調作用依賴于IFN-γ受體和STAT1。Western blotting發(fā)現(xiàn)BMM細胞感染MHV-68后，IFN-γ上調TLR9可使IRF7磷酸化增強。抑制劑或者小干擾RNA抑制TLR9后，Ⅰ型干擾素產生明顯下降，伴隨著IFN-γ的抗病毒作用減弱。通過ChIP-qPCR實驗，我們發(fā)現(xiàn)p-STAT1不能與TLR9的啟動子區(qū)結合。
　　本文的第四部分，我們研究了病毒拮抗IFN-γ的作用及相關的機制，發(fā)現(xiàn)MHV-

13、68感染BMM細胞可以誘導SOCS1產生，抑制STAT1的磷酸化從而抑制IFN-γ的抗病毒作用。通過檢測病毒的生長曲線，發(fā)現(xiàn)IFN-γ誘導的抗病毒作用在MHV-68感染的BMM細胞逐漸減弱，Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)隨著感染時間延長，STAT1磷酸化水平被抑制。通過篩選JAK-STAT1負向調控因子發(fā)現(xiàn)MHV-68感染BMM細胞可以上調SOCS1的表達，且UV滅活的MHV-68無法誘導SOCS1產生。BMM細胞轉染SOCS

14、1特異性的siRNA可以逆轉這一現(xiàn)象，表現(xiàn)為IFN-γ的抗病毒作用增強且誘導的STAT1磷酸化持續(xù)活化。通過轉染TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9特異性的siRNA檢測SOCS1的表達，發(fā)現(xiàn)下調TLR3的表達，SOCS1產生明顯下降;且TLR3信號通路激動劑poly(I∶C)可以誘導SOCS1的表達;BMM細胞干擾或者敲除MyD88對SOCS1產生沒有影響。Western blotting檢測MHV-68感染后TLR3下游

15、信號通路活化情況，發(fā)現(xiàn)MHV-68感染BMM細胞可以活化NF-κB、p38、ERK、JNK信號通路。用這些信號通路的特異性抑制劑處理細胞后顯示只有抑制NF-κ B后，SOCS1產生下降。最后，我們取不表達TLR3的NIH3T3細胞，IFN-γ處理可以持續(xù)抑制MHV-68的復制，表現(xiàn)為病毒滴度持續(xù)下降，并且STAT1磷酸化水平保持穩(wěn)定。過表達SOCS1可使IFN-γ的抗病毒作用減弱，伴隨著STAT1磷酸化水平的下降。
　　結論：

16、r>　　1.DIP MHV-68病毒無法在BALB/c小鼠體內建立裂解復制和潛伏感染并可誘導機體產生大量的IFN-γ，說明IFN-γ可能在此過程中發(fā)揮了重要的作用且野生病毒存在抑制IFN-γ產生的機制。
　　2.IFN-γ可直接抑制MHV-68的復制且抑制效應具有廣泛性:IFN-γ經與IFN-γ受體結合，抑制MHV-68在巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞的復制。
　　3.在BMM細胞，IFN-γ抑制MHV-68存在新的機制:I

17、FN-γ通過上調Toll樣受體9的表達，誘導Ⅰ型干擾素產生，Ⅰ型干擾素與Ⅱ型干擾素協(xié)同發(fā)揮抗病毒的作用。
　　4.MHV-68利用宿主因素作為病毒拮抗IFN-γ的機制以利于病毒的存活:在BMM細胞，MHV-68感染活化TLR3-TRAF-NF-κB信號通路產生宿主性細胞因子SOCS1抑制STAT1磷酸化從而抑制IFN-γ的抗病毒效應。
　　創(chuàng)新性：
　　1.以鼠γ皰疹病毒MHV-68為研究模型，率先構建了一個裂解復制、

18、潛伏感染、免疫逃逸缺陷的重組病毒DIP。通過對該病毒的研究，有助于我們了解病毒潛伏感染、免疫逃逸機制及γ皰疹病毒如EBV、KSHV的致瘤機制。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)IFN-γ通過上調TLR9的表達，進而促進Ⅰ型干擾素的產生。我們的研究除了闡明IFN-γ抑制MHV-68裂解復制的機理外，還有助于了解Ⅰ型干擾素和Ⅱ型干擾素在腫瘤相關病毒感染過程中的相互關系。
　　3.闡明MHV-68感染BMM細胞可以誘導宿主產生SOCS1來抑制IF