玫瑰微球菌麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)研究.pdf

1、海藻糖因其獨(dú)特的生物學(xué)功能近年來(lái)被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞、組織器官、食品、化妝品和藥物制劑、保藏等領(lǐng)域。由麥芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyl trehalose synthase，MTSase）和麥芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyl trehalose trehalohy-drolase，MTHase）組成的雙酶體系可以將淀粉轉(zhuǎn)化成海藻糖，可望成為工業(yè)生產(chǎn)海藻糖的新途徑。 本文主要構(gòu)建了來(lái)源于玫瑰微球菌的

2、MTHase蛋白的pPICZAα重組表達(dá)載體，在巴斯德畢赤酵母表達(dá)體系中進(jìn)行了分泌表達(dá)研究。 首先根據(jù)TreZ基因序列設(shè)計(jì)引物，以玫瑰微球菌基因組為模板，擴(kuò)增得到1．9Kb目的基因片段。與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR及測(cè)序驗(yàn)證，序列測(cè)定結(jié)果與報(bào)道完全一致。 目的片段經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切處理后定向插入pPICZαA質(zhì)粒中，成功構(gòu)建了MTHase的分泌表達(dá)載體pPICZαA

3、-MTH。重組質(zhì)粒經(jīng)線性化分別電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入Pichia pastoris GS115及KM71菌株中，通過(guò)Zeocin濃度梯度篩選高拷貝重組菌株，最終在1000μg/ml的濃度下得到若干個(gè)單菌落。對(duì)得到的GS115菌株進(jìn)行表型驗(yàn)證，證明均為Mut+。 通過(guò)測(cè)定重組GS115（pPICZαA-MTH）及KM71（pPICZαA-MTH）菌株在BMGY培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線，以及BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中總蛋白含量隨時(shí)間的變化曲線，確定的最佳轉(zhuǎn)接

4、時(shí)間分別為20h和25h，甲醇誘導(dǎo)時(shí)間為72h。 SDS-PAGE結(jié)果顯示，經(jīng)0．5%甲醇28℃下誘導(dǎo)72h后，KM71（pPICZαA-MTH）菌株發(fā)酵液樣品約72．5KD處出現(xiàn)明顯條帶，而GS115（PICZAα-MTH）菌株沒(méi)有預(yù)期條帶。KM71（pPICZαA-MTH）菌株樣品western blot出現(xiàn)單一條帶，GS115（pPICZαA-MTH）未出現(xiàn)條帶，進(jìn)一步證明MTHase蛋白在KM71菌株中成功表達(dá)，而在G