肝癌微環(huán)境中M2型腫瘤相關巨噬細胞對肝癌轉移功能的影響及其機制研究.pdf

1、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤，死亡率居所有惡性腫瘤死亡率的第二位。腫瘤微環(huán)境(tumormicroenvironment，TME)是指腫瘤發(fā)生發(fā)展的局部病理環(huán)境。腫瘤的發(fā)生發(fā)展和復發(fā)轉移不僅由惡性腫瘤細胞自身決定，而且與腫瘤微環(huán)境中非腫瘤細胞成分密切相關，腫瘤微環(huán)境已經成為癌癥基礎研究領域的熱點。腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophage，TAM)

2、是腫瘤微環(huán)境中眾多炎癥細胞的主要成員，約占炎癥細胞總數(shù)的30％-50％。本研究中，我們在體外誘導培養(yǎng)M2型腫瘤相關巨噬細胞的基礎上，采用BioLevitatorTM三維細胞培養(yǎng)儀，模擬體內腫瘤微環(huán)境在體外建立M2型腫瘤相關巨噬細胞與肝癌細胞的立體共培養(yǎng)體系;運用iTRAQ與質譜相結合的定量蛋白質組學技術，建立M2型腫瘤相關巨噬細胞與肝癌細胞立體共培養(yǎng)體系外分泌蛋白質的差異表達譜;基于生物信息學分析技術結合文獻報道篩選其中的關鍵差異蛋白質

3、分子，明確其對肝癌轉移功能的影響，并進一步采用RT-PCR和Westernblot等技術深入探討其促進肝癌轉移的分子機制。本研究旨在從蛋白質組學的角度闡明M2型腫瘤相關巨噬細胞促進肝癌轉移的分子機制，為今后肝癌轉移的靶向治療提供新思路。
　　第一部分 M1和M2兩種極化的巨噬細胞模型的體外誘導與鑒定
　　巨噬細胞由血液中的單核細胞分化而來，是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機體特異性免疫防御和非特異性免疫防御中均發(fā)揮重要作用。

4、巨噬細胞是一類動態(tài)變化的免疫細胞群，表型的異質性和功能的多樣性是其主要的特征。巨噬細胞在不同的微環(huán)境能夠發(fā)生不同性質的活化，分化成為具有不同表型標志物和功能特征的細胞亞群。研究表明，巨噬細胞的極化主要包括兩種類型:一種是經典激活的巨噬細胞(classic activation ofmacrophage，M1)，另一種是替代激活的巨噬細胞(alternative activationof macrophage，M2)。本部分旨在體外建立M

5、1和M2兩種極化的巨噬細胞模型，為后繼的研究奠定基礎。我們在使用佛波酯(PMA)將人單核細胞白血病細胞THP-1體外誘導分化成為未分化的巨噬細胞(unactivatedmacrophage，UaM)的基礎上，選用脂多糖(LPS)和IFN-γ為M1型巨噬細胞的誘導劑，選用IL-4和IL-13為M2型巨噬細胞的誘導劑，使用倒置相差顯微鏡觀察誘導后的細胞形態(tài)變化，采用流式細胞術(FCM)檢測M1和M2兩種巨噬細胞表面分子CD68、CD206和

6、CD163的表達水平，用ELISA檢測M1和M2兩種巨噬細胞培養(yǎng)上清液中IL-10和IL-12的分泌水平，用熒光定量PCR檢測M1和M2兩種巨噬細胞不同表型分子標志物TNF-α、CCL3、iNOS、Arg-1、AMAC-1和CCL22 mRNA的相對表達水平。結果顯示，M1型巨噬細胞呈不規(guī)則形或者長梭形，高表達IL-12、TNF-α、CCL3和iNOS; M2型巨噬細胞多呈圓形或類圓形，抱團生長，高表達IL-10、CD206、CD163

7、、Arg-1、AMAC-1和CCL22，研究結果與文獻報道相符，表明我們成功建立了M1和M2兩種極化的巨噬細胞模型。
　　第二部分 M2型腫瘤相關巨噬細胞在肝癌細胞侵襲和上皮間質轉化中的作用研究
　　上皮間質轉化(Epithelial mesenchymaltransition，EMT)是上皮源性腫瘤轉移的首要步驟，已成為腫瘤轉移研究的焦點。肝癌是一種典型的上皮源性腫瘤，復發(fā)、轉移和缺乏有效的治療手段是導致其高死亡率的主要原

8、因，轉移復發(fā)已經成為提高肝癌治療效果與生存率的最大障礙。腫瘤的發(fā)生發(fā)展和復發(fā)轉移不僅由惡性腫瘤細胞自身決定，而且與腫瘤微環(huán)境密切相關。腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關巨噬細胞主要是M2型腫瘤相關巨噬細胞。本部分主要研究M2型腫瘤相關巨噬細胞對肝癌細胞侵襲、遷移和粘附能力以及上皮間質轉化的影響，探討M2型腫瘤相關巨噬細胞在肝癌轉移中的作用。我們在體外將人單核白血病細胞THP-1誘導分化成為M2型腫瘤相關巨噬細胞的基礎上，采用transwell小室建

9、立M2型腫瘤相關巨噬細胞與肝癌細胞Huh7和SMMC7721的共培養(yǎng)體系，利用侵襲實驗、遷移實驗和粘附實驗檢測共培養(yǎng)后Huh7和SMMC7721細胞侵襲、遷移和粘附能力的變化，用熒光定量PCR檢測共培養(yǎng)前后Huh7和SMMC7721細胞EMT相關標志物E-cadherin, N-cadherin, Vimentin和α-smooth muscle actin(α-SMA)mRNA的相對表達水平。結果顯示，與M2型腫瘤相關巨噬細胞共培養(yǎng)4

10、8 h后，肝癌細胞Huh7和SMMC7721形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，由原來上皮細胞形態(tài)轉變成為一種梭形的間質細胞形態(tài)，細胞的侵襲和遷移能力增強，而粘附能力下降。熒光定量PCR顯示，共培養(yǎng)后Huh7和SMMC7721細胞上皮標志物E-cadherinmRNA相對表達水平下降，間質標志物N-cadherin，Vimentin和α-SMA mRNA相對表達水平上升，表明M2型腫瘤相關巨噬細胞通過誘導肝癌細胞發(fā)生EMT促進肝癌細胞侵襲。
　

11、　第三部分 M2型腫瘤相關巨噬細胞與肝癌細胞的三維立體共培養(yǎng)體系的建立及關鍵差異蛋白的篩選與驗證
　　分泌蛋白質組(secretome)是指在一定的時間和空間條件下，組織和細胞等分泌的全部蛋白質。分泌蛋白質組學(Secretomics)是指利用蛋白質組學(proteomics)技術對分泌蛋白質進行廣泛和深入的研究。腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細胞與間質細胞相互作用，相互影響，共同決定了腫瘤細胞的歸宿。在腫瘤細胞與間質細胞相互作用的過程中，腫

12、瘤微環(huán)境中的分泌蛋白質充當了“橋梁”的作用，其功能網絡是維持腫瘤與間質穩(wěn)態(tài)，決定腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要媒介。本部分中，我們應用BioLevitatorTM三維細胞培養(yǎng)儀，模擬體內腫瘤微環(huán)境在體外建立M2型腫瘤相關巨噬細胞與肝癌細胞的立體共培養(yǎng)體系;運用iTRAQ與質譜相結合的定量蛋白質組學技術，建立M2型腫瘤相關巨噬細胞與肝癌細胞立體共培養(yǎng)體系外分泌蛋白質的差異表達譜;采用生物信息學分析技術結合文獻報道篩選其中的關鍵差異蛋白質分子，并使用W

13、estern blot對部分關鍵差異蛋白質分子進行表達驗證，為進一步深入探討腫瘤微環(huán)境中M2型腫瘤相關巨噬細胞與肝癌細胞的相互作用，闡明M2型腫瘤相關巨噬細胞促進肝癌轉移的分子機制提供實驗依據(jù)。
　　第四部分 巨噬細胞源性IL-1β對肝癌細胞轉移功能的影響及其分子機制研究
　　肝癌是一種經典的炎癥伴隨腫瘤，病因以慢性肝炎病毒感染為主，具有慢性炎癥改變和免疫調節(jié)紊亂兩大病變基礎。隨著慢性炎癥在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用得到進一步解析

14、，炎癥與腫瘤轉移的關系已經引起廣泛關注。白細胞介素1β(interleukin1β，IL-1β)是體內炎癥反應和免疫調節(jié)的核心介質，主要由炎癥狀態(tài)下或免疫反應中巨噬細胞和單核細胞產生，其對肝癌轉移功能的影響及相關機制尚不明確。本部分中，我們使用外源性重組人IL-1β誘導培養(yǎng)肝癌細胞SMMC7721，采用侵襲實驗、遷移實驗和粘附實驗檢測IL-1β對肝癌細胞SMMC7721侵襲能力、遷移能力和粘附能力的影響，用熒光定量PCR檢測EMT相關標

15、志物mRNA的相對表達水平，用Western blot檢測IL-1β誘導不同時間點SMMC7721細胞NF-κ B通路信號分子NF-κB（p65，胞核）、IκBα（胞漿）和P-IκBα（胞漿）以及EMT相關標志物Snail的蛋白表達水平。結果顯示，IL-1β誘導48 h后，SMMC7721細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細胞向成纖維細胞樣梭形改變;細胞的侵襲和遷移能力增強，粘附能力下降;細胞上皮標志物E-cadherin mRNA表達水平下降

16、，間質標志物N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、ZEB1和ZEB2mRNA表達水平上升;Western blot結果顯示IL-1β誘導后NF-κB(p65，胞核)、P-IκBα（胞漿）和Snail蛋白表達上調，IκBα（胞漿）蛋白表達下調，并且具有明顯的時間依賴性。另外，NF-κB通路特異性抑制劑BAY11-7082處理能夠減弱甚至逆轉IL-1β對肝癌細胞SMMC7721轉移潛能及EMT的促進作用。研究結果表明

17、，IL-1β通過NF-κB/Snail途徑誘導肝癌細胞發(fā)生EMT，進而促進肝癌細胞的轉移潛能，阻斷NF-κ B通路能夠顯著降低IL-1β對肝癌細胞轉移潛能的促進作用，IL-1β可能是肝癌轉移的潛在治療靶點。
　　1.體外成功誘導并建立了M1和M2兩種極化的巨噬細胞模型。
　　2.M2型腫瘤相關巨噬細胞主要通過誘導肝癌細胞發(fā)生EMT增強肝癌細胞侵襲和轉移的潛能。
　　3.成功應用BioLevitatorTM三維細胞培養(yǎng)儀

18、模擬體內腫瘤微環(huán)境在體外建立了M2、SMMC7721以及M2+SMMC7721的三種立體培養(yǎng)體系，并運用iTRAQ與質譜相結合的定量蛋白質組學技術，建立了三種立體培養(yǎng)體系外分泌蛋白質的差異表達譜，其中IL-1β是M2型腫瘤相關巨噬細胞與SMMC7721細胞共培養(yǎng)相互誘導產生的關鍵差異蛋白質分子，與腫瘤轉移密切相關。
　　4.IL-1β主要通過參與調節(jié)NF-κB/Snail信號通路影響肝癌細胞的EMT進程，最終發(fā)揮其促進肝癌細胞轉移