八寶丹對小鼠急性酒精性肝損傷的干預(yù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　急性酒精性肝損傷(acute alcoholic liver injury)是指短期內(nèi)大量飲酒導(dǎo)致肝臟損傷的疾病，是世界性的公共衛(wèi)生問題，其患病率和發(fā)病率呈逐年上升趨勢。酒精性肝病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)、多種細(xì)胞因子和自噬等有關(guān)。近年來，對酒精性肝病發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究雖然取得了一定進(jìn)步，但是迄今為止尚無特效治療方法。
　　微環(huán)境的穩(wěn)定是保持細(xì)胞生長、增殖、功能和代謝的重要因素。急性酒精性肝損傷的

2、發(fā)生發(fā)展與肝細(xì)胞微環(huán)境（如氧化還原狀態(tài)）的改變密切相關(guān)。機(jī)體大量飲酒后會(huì)引起肝細(xì)胞的微環(huán)境發(fā)生明顯改變。酒精進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)肝臟代謝釋放出的過氧化氫(H2O2)及超氧陰離子(O2-)能夠促使ROS(Reactive oxygen species，ROS)的聚集，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。同時(shí)，酒精誘導(dǎo)產(chǎn)生的CYP2E1(cytochrome P450 family2，subfamily E，polypeptide1)，能夠調(diào)節(jié)和激活毒性物質(zhì)相關(guān)反

3、應(yīng)并進(jìn)一步促使ROS聚集，參與脂質(zhì)過氧化作用，從而促進(jìn)肝細(xì)胞損傷。在酒精性肝損傷過程中，乙醇代謝產(chǎn)物和ROS的毒效應(yīng)均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死，不僅能引起肝細(xì)胞形態(tài)的改變、脂肪變性，而且還造成其它組織器官的損傷。隨著對急性酒精性肝損傷研究的深入，以改善微環(huán)境為策略的治療研究備受關(guān)注。然而，由于微環(huán)境具有多樣的生物特性以及復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，單通過調(diào)控其中某一基因或某一類相關(guān)細(xì)胞難以獲得理想的療效。
　　中藥具有多效性和多向調(diào)節(jié)的特性，得到

4、了國內(nèi)外的廣泛認(rèn)可。八寶丹是我國重要的保護(hù)類中藥，在臨床上用于防治多種肝膽類疾?。ㄈ鐐魅拘圆《拘愿窝住⒓毙阅懩已?、重型病毒性肝炎等），且療效顯著，但八寶丹治療酒精性肝損傷的相關(guān)研究未見報(bào)道。八寶丹主要是由牛黃、蛇膽、羚羊角、珍珠、三七、麝香等八種藥材組成，內(nèi)含多種有效成分，如?；撬?、麝香酮、?；悄懰?、皂苷及黃酮類。這些有效成分協(xié)同作用，治療疾病。
　　八寶丹在臨床上治療肝膽炎癥有明確療效，且急性酒精性肝損傷的發(fā)生發(fā)展與肝細(xì)胞的微環(huán)

5、境變化密切相關(guān)。因此我們推測，八寶丹可能通過改善肝細(xì)胞的微環(huán)境抑制急性酒精性肝損傷的發(fā)生發(fā)展。本課題利用小鼠急性酒精性肝損傷模型，給予八寶丹處理，檢測血清肝功能相關(guān)指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和甘油三酯(TG);并采用HE染色、油紅染色、CCK8、氧化敏感探針(DCFH-DA)染色、Western blotting、Real-time PCR以及轉(zhuǎn)染si-RNA等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法研究和探討八寶丹在急性酒精性肝損傷過程中的作

6、用及其機(jī)制。
　　方法及結(jié)果:
　　第一部分:構(gòu)建小鼠急性酒精性肝損傷模型并給予八寶丹灌胃處理，觀察小鼠醉酒情況、檢測血清中肝功能相關(guān)指標(biāo)的變化如ALT、AST、TG的水平，HE染色和油紅染色檢測肝臟脂肪變性的程度。利用CCK8實(shí)驗(yàn)方法檢測不同分組中AML-12細(xì)胞的增殖活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示八寶丹對急性酒精性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用。而且八寶丹的保護(hù)作用具有劑量依賴性:在一定的濃度內(nèi)，隨著八寶丹劑量地增加，其對肝損傷的保護(hù)效應(yīng)

7、逐漸增大。
　　第二部分:采用DCFH-DA染色方法檢測八寶丹對肝細(xì)胞ROS的表達(dá);利用Real-time PCR和Western Blotting實(shí)驗(yàn)方法檢測肝細(xì)胞中CYP2E1、Nrf2、HO-1、GCLC基因的表達(dá);相關(guān)試劑盒檢測肝細(xì)胞中MDA、ADH、SOD、GSH、CAT、GPx水平，利用siRNA技術(shù)和抑制劑干擾肝細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)觀察八寶丹對急性酒精性肝損傷的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示八寶丹能夠抑制了CYP2E1的分泌、減