胞外蛋白酶抑制劑基因expi對大鼠肝再生的作用研究.pdf

1、胞外蛋白酶抑制劑基因expi編碼的蛋白與蛋白酶活性的有關，并參與細胞的遷移和凋亡活動。本實驗室的大鼠再生肝RatGenome230.20芯片檢測結果表明，expi在大鼠2/3肝切除后6h起始表達，6-72h持續(xù)表達上調，并在30h達到表達高峰，是對照的33倍。但目前還沒有人研究其在肝在生中的功能，而作為重要生命活動的肝再生也涉及蛋白質降解，細胞遷移和凋亡等生理生化活動，了解該基因在肝再生中的功能，有助于揭示肝再生分子機制。為此，本文挑選

2、出基因expi，以Higgins等那建立的大鼠2/3肝切除模型做為研究對象，利用大鼠尾靜脈液壓轉基因技術，通過基因添加和RNA干涉的方法，研究expi在大鼠肝再生中的作用。
　　 根據(jù)expi的基因序列設計引物并克隆該基因，同時設計其兩條RNA干涉片段，然后進行載體的構建。將上述測序正確的基因及其干涉片段連接到不同的載體上，構建三套載體：一套是表達載體pEGFP-N1-expi，用于基因添加實驗；另一套是干涉載體，包括pGene

3、si1-1.0-E6和pGenesi1-1.0-E147,用于干涉目的的基因的實驗；最后一套是檢驗載體，包括pGenesi1-1.0-E6-expi,pGenesi1-1.0-E147-expi和pGenesi1-1.0-HK-expi,用于檢驗設計的兩條干涉片段是否對靶基因產生干涉作用。
　　 將構建的三條檢驗載體分別進行尾靜脈液壓轉基因操作，通過觀察轉干涉檢驗載體和綠恍熒光蛋白陽性細胞率（轉染率）相較對照檢驗載體是否有明顯減

4、少，來判斷設計的干涉片段是否對靶位點具有干涉作用。將表達載體和干涉載體分別進行液壓轉基因操作，分別在轉基因后6、12、24、36、48、60、72和84h取材觀察其綠色熒光蛋白陽性細胞率、通過統(tǒng)計分析得出各載體在大鼠肝臟組織中表達高峰的時間點，結合expi芯片檢測結果，得出2/3肝切除后的最佳轉基因時間。根據(jù)以上結果，利用2/3肝切除手術制備的大鼠肝再生模型和液壓轉基因技術展開expi對大鼠肝再生過程影響的研究。將制備好的轉基因后的再生

5、肝材料分別于2/3肝切除后72、120和168h取出，用熒光顯微技術、統(tǒng)計學方法的常規(guī)組織學技術對死亡率、表達動力學、肝指數(shù)和組織形態(tài)結構等方面結果進行觀察與分析。
　　 測序和電泳檢測結果顯示：基因expi克隆成功，其表達載體、干涉載體和檢驗載體構建成功。熒光觀察結果表明，轉檢驗載體pGenesil-1.0-E6-expi和pGenesi1-1.0-E147-expi的綠色熒光蛋白陽性細胞率明顯低于其對照載體pGenesi1-

6、1.0-HK-expi，這說明設計的兩干涉片段對靶位點均具有干涉作用。轉表達載體pEGFP-N1-expi和干涉載體pGenesi1-1.0-E6與pGenesi1-1.0-E147后，統(tǒng)計分析陽性細胞率得出各載體在大鼠肝臟組織中表達高峰的時間點是轉基因后12h，結合expi芯片檢測結果，得出最佳轉基因時間點是2/3肝切除后18h。
　　 肝指數(shù)檢測結果表明，在進行expi基因添加時，肝指數(shù)高于對照；進行expi基因干涉時，肝指