中草藥DNA整合鑒定系統(tǒng)研究——以含馬兜鈴酸類藥材和穿龍薯蕷為例.pdf

1、中草藥的真?zhèn)舞b定是保證其療效和安全性的基礎。隨著現代科學技術的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)的中藥鑒定方法不斷吸收新技術和新方法，推動中藥鑒定由傳統(tǒng)鑒定向現代鑒定發(fā)展，為了滿足種類繁多的中草藥的鑒別需求，結合傳統(tǒng)鑒定技術來建立綜合的中草藥 DNA鑒定系統(tǒng)是非常有必要的。本文以含馬兜鈴酸類藥材和薯蕷屬近緣物種為研究對象，分別采用TaqMan探針、LAMP技術和DNA條形碼技術對馬兜鈴科植物及其混用品進行快速檢測和物種鑒定，超級條形碼葉綠體基因組對穿龍薯蕷

2、及同屬近緣物種進行鑒定，超高效液相-高分辨質譜聯(lián)用技術（UHPLC-HR-MS）對馬兜鈴科植物和其易混淆物種進行化學成分檢測，并在此基礎上提出了中草藥DNA整合鑒定系統(tǒng)的設想和構成，為綜合鑒定種類繁多的中草藥以及解決一些鑒定難題奠定了基礎。
　　本文采用TaqMan探針來快速、準確的鑒定馬兜鈴科植物。馬兜鈴酸（AAs）是一類存在于馬兜鈴科植物中的有機化合物，該科多種植物作為中藥材在廣泛使用。然而，由于相近的中文名稱、相似的用藥習慣

3、以及植物形態(tài)，馬兜鈴科植物容易和其它藥材混淆和混用，由此導致的馬兜鈴酸腎病事件曾引起極大關注。然而，主要依賴于性狀特征和顯微特征的傳統(tǒng)鑒定方法，很難準確鑒定喪失了一些性狀信息的干燥植物材料或者某個藥材部位。為了保護消費者的權益，迫切需要建立一套鑒別含馬兜鈴酸植物的有效方法。本研究全面系統(tǒng)的收集了馬兜鈴科植物及被其混用的物種289份，隸屬于13科24屬79個物種，其中馬兜鈴科的四個屬（馬兜鈴屬、細辛屬、馬蹄香屬、線果兜鈴屬）46個物種共有

4、158份樣品，其易混淆物種隸屬于12科20屬33個物種共131份樣品。從收集的289份樣品中得到了282條 ITS2序列。在此基礎上，根據馬兜鈴科植物的 ITS2序列信息，我們設計了11對引物和探針組合，能夠靈敏準確的檢測到馬兜鈴科植物的正常熒光信號，因此，基于Real-Time PCR的TaqMan探針技術可快速準確的檢測出馬兜鈴科植物。
　　采用LAMP方法對木通和關木通進行快速可視化鑒別。2015版《中國藥典》規(guī)定木通來源于

5、木通Akebia quinata(Houtt.) Decne.、三葉木通Ak. trifoliata(Thunb.) Koidz.和白木通Ak. trifoliata(Thunb.) Koidz. var. australis(Diels) T. Shimizu的干燥藤莖。關木通藥材則為木通馬兜鈴Aristolochia manshuriensisKomarov的干燥藤莖。本文基于木通馬兜鈴Ar. manshuriensis的ITS2序

6、列設計并經過預實驗篩選得到了一組LAMP引物，包括四條普通引物(G-F3, G-B3, G-FIP, G-BIP)和一條環(huán)引物(G-LB)。在65℃下進行等溫擴增，60 min內成功完成LAMP擴增反應，并且同時可進行可視化檢測。關木通的三份樣品 LAMP反應呈陽性，LAMP反應開始于25-30 min并且在45-60 min接近飽和。相對的，木通的三個基原物種共9份樣品在60 min的反應時間內都呈現陰性。當LAMP反應結束時，關木通

7、的樣品即陽性樣品的產物顏色從開始的橙色變成綠色，但是陰性樣品即木通的顏色一致保持橙色沒變。通過與傳統(tǒng)PCR比較，我們發(fā)現LAMP反應的靈敏度比傳統(tǒng)PCR高10倍，這證明了對于檢測關木通，LAMP技術是可行的并且是有優(yōu)勢的。LAMP技術是一個潛在的、有價值的、簡單有效的快速鑒別木通和混偽品關木通的方法。
　　采用DNA條形碼技術對馬兜鈴科植物及其混用品進行物種鑒別。本研究全面系統(tǒng)的收集了馬兜鈴科植物及被其混用的物種289份，隸屬于1

8、3科24屬79個物種，其中馬兜鈴科的四個屬（馬兜鈴屬、細辛屬、馬蹄香屬、線果兜鈴屬）46個物種共有158份樣品，其易混淆物種隸屬于12科20屬33個物種共131份樣品，此外，還從GenBank中下載了細辛屬13個物種的15條ITS2序列和非馬兜鈴科混用物種的6條ITS2序列和4條psbA-trnH序列。從收集的289份樣品中得到了282條ITS2序列和185條psbA-trnH序列，所得序列已經提交至GenBank數據庫。DNA條形碼技

9、術研究結果表明，使用BLAST1、最近距離法在屬級水平鑒定馬兜鈴科和非馬兜鈴科混用物種的鑒定效率為100％。在NJ（neighbor-joining）樹中，馬兜鈴科植物聚為一支，非馬兜鈴科混用物種聚為另一支。因此，以ITS2為主，psbA-trnH為輔的DNA條形碼技術能快速準確的鑒別馬兜鈴科及其非馬兜鈴科混用物種。
　　本文采用超級條形碼葉綠體基因組來解決DNA條形碼無法鑒別的部分近緣物種，以薯蕷屬植物穿龍薯蕷和其同屬近緣植物的

10、鑒別為實例。穿龍薯蕷Dioscorea nipponicaMakino是薯蕷科薯蕷屬一個重要的藥用植物，薯蕷科植物對于單子葉植物的進化非常重要。在前期的研究中發(fā)現對于薯蕷屬植物的鑒定，并沒有篩選到合適的條形碼。在本文中，我們測定了穿龍薯蕷D. nipponica的葉綠體基因組。采用Illumina Miseq300基因組分析儀測序，Soapdenovo suite進行拼接，同屬物種龜甲龍D. elephantipes(NC_009601

11、.1)的葉綠體基因組作為參考基因組。拼接好的序列已經提交到GenBank上，登錄號為KP404629。穿龍薯蕷的葉綠體基因組總長度為152,946 bp，富含AT堿基(含量為63.3%)，包含一對23,113 bp反向重復區(qū)、大單拷貝區(qū)(LSC)長度為83,557 bp和小單拷貝區(qū)(SSC)長度為23,064 bp。共編碼120個基因，包含89個蛋白編碼基因、27個tRNA基因和4個 rRNA基因。預測的基因編碼區(qū)覆蓋了基因組序列的58

12、.7%，其中12個基因包含有內含子。系統(tǒng)進化樹分析顯示葉綠體基因組可以作為鑒定穿龍薯蕷和其同屬近緣物種的一個超級條形碼，而且，此葉綠體基因組將為繼續(xù)研究穿龍薯蕷提供分子基礎。
　　本文采用 UHPLC-HR-MS技術定性檢測馬兜鈴科植物及其混用品當中的AAⅠ和AAⅡ。本研究廣泛系統(tǒng)的收集了馬兜鈴科和非馬兜鈴科的易混淆物種，以AAⅠ和AAⅡ為對照品，通過UHPLC-HR-MS檢測馬兜鈴科45個物種和非馬兜鈴科30個物種，AAⅠ和AA

13、Ⅱ分別在m/z340.0469和310.0366被檢測，實驗結果顯示馬兜鈴科39個物種含有AAⅠ，這其中有14個物種同時也含有AAⅡ，非馬兜鈴科的植物不含有AAⅠ和Ⅱ，檢測結果進一步證實大部分馬兜鈴科植物含有馬兜鈴酸，為鑒別含馬兜鈴酸植物提供了一個有效的驗證方法。
　　現代科學技術已經在藥用植物鑒定方面顯示了很大的優(yōu)勢，那么面對繁多的新方法、新技術，如何根據不同的鑒別需求來選擇合適的鑒定方法是大家都關注的重點，本文通過分析具體案例

14、并結合傳統(tǒng)鑒定技術，建立了中草藥DNA整合鑒定系統(tǒng)，提出了DNA整合鑒定系統(tǒng)的構成和方法流程，為選擇合適的鑒定方法提供了依據，為控制中藥材的來源和質量奠定了基礎，為保護消費者的權益提供了保證。
　　中草藥DNA整合鑒定系統(tǒng)的構成為：以TaqMan探針和LAMP方法為主體的現場快速檢測體系、DNA條形碼鑒別體系、超級條形碼葉綠體基因組鑒別近緣物種體系。從應用性角度將中草藥DNA整合鑒定系統(tǒng)的鑒定流程分為以下四個部分：第一，為了滿足快

15、速、靈敏和簡便的鑒別目的，可采用快速檢測體系對中藥材進行現場快速鑒定。第二，為了構建DNA條形碼數據庫或者進行物種鑒定和溯源，可采用DNA條形碼技術得到物種的條形碼序列并進行物種鑒定及溯源。第三，對于DNA條形碼鑒別無法解決的近緣物種，可采用超級條形碼葉綠體基因組鑒別。第四，對于可正常獲取DNA的常規(guī)樣品，LC或LC-MS檢測方法可用來驗證DNA鑒別方法；而對于 DNA降解嚴重和獲取 DNA困難的鑒別對象，LC或LC-MS檢測方法可用作