CDK抑制劑SNS-032對(duì)急性髓系白血病的殺傷作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）是造血細(xì)胞惡性克隆性病變，其特點(diǎn)是白血病細(xì)胞在骨髓顯著增生，抑制正常造血。成人AML的發(fā)生率明顯高于急性淋巴細(xì)胞白血病，是最常見的急性白血病;并隨年齡的增長(zhǎng)而增加。目前采用聯(lián)合化療、造血干細(xì)胞移植等手段延長(zhǎng)患者生存期，但仍有很大一部分患者無法耐受大劑量化療副作用，或使用常規(guī)藥物無效，最終復(fù)發(fā)。惡性腫瘤靶向藥物研究是白血病治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，目前已有多種小分子抑制劑治療AML進(jìn)入臨床研究。細(xì)

2、胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)在調(diào)控細(xì)胞周期和基因轉(zhuǎn)錄中起重要作用，AML常有CDK活性異常增高，因此CDK抑制劑可能在治療AML中發(fā)揮重要作用。
　　目的：
　　1、研究CDK抑制劑SNS-032在體外對(duì)AML細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用;
　　2、研究小分子抑制劑SNS-032對(duì)AML細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用;
　　3、研究白細(xì)胞介素6能否逆轉(zhuǎn)SNS-032對(duì)AML的殺傷作用，從而克服耐藥;
　　4、通過基因芯片和蛋

3、白印跡實(shí)驗(yàn)研究SNS-032對(duì)白血病細(xì)胞殺傷的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活性。收集藥物處理后的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色后，通過顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，就可以對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行比較精確的定量。
　　2、應(yīng)用MTT法，檢測(cè)SNS-032對(duì)白血病細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制作用。
　　3、應(yīng)用流式細(xì)胞儀，檢測(cè)SNS-032作用后白血病細(xì)胞的凋亡情況。
　　4、基因芯片分析miRNA，檢測(cè)SNS-032作用前后micr

4、oRNA（miRNA）表達(dá)水平。
　　5、應(yīng)用Western blot，檢測(cè)SNS-032作用后JAK2/STAT3蛋白和CDK下游抗凋亡蛋白Mcl-1和c-myc表達(dá)情況以及IL-6對(duì)試驗(yàn)組JAK2/STST3蛋白表達(dá)的影響。
　　6、統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Prime4軟件統(tǒng)計(jì)，比較采用Dunnett-t法。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、 SNS-032對(duì)人AML不同細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用:我們采用臺(tái)盼藍(lán)染色，通過人AML細(xì)

5、胞株用藥前及不同濃度下用藥24h、48h后的拒染率分析，闡述不同人AML細(xì)胞株對(duì)SNS-032作用的反應(yīng)。SNS-032濃度分別為25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L，結(jié)果顯示，SNS-032對(duì)各細(xì)胞株均有生長(zhǎng)抑制作用，且呈濃度依賴性;其中MV4-11、U937細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制尤為明顯,MV4-11細(xì)胞株24小時(shí)100nmol/L藥物作用后平均拒染率為67.3％，48小時(shí)拒染率為53％，U937細(xì)胞株24小時(shí)100nmo

6、l/L藥物作用后平均拒染率為71.7％，48小時(shí)拒染率為53.4％。
　　2、 SNS-032對(duì)人AML細(xì)胞株的誘導(dǎo)凋亡作用:采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度SNS-032(100nmol/L、200nmol/L)作用于人AML細(xì)胞株24h，細(xì)胞的數(shù)量百分比變化，結(jié)果顯示，SNS-032為100nmmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率達(dá)12.1％，當(dāng)SNS-032為200nmmol/L時(shí)凋亡率達(dá)59.4％，提示凋亡細(xì)胞呈濃度依賴性。
　　3、

7、 SNS-032對(duì)人AML細(xì)胞株miRNA的影響:應(yīng)用microRNA(miR)芯片分析SNS-032作用前后miR的差異表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNS-032顯著下調(diào)miR-30a、miR-183、miR-20b、miR-20a、miR-589、miR-107、miR-181a、miR-106a、miR-17、miR-378c的表達(dá)水平，顯著上調(diào)has-miR-320a。
　　4、SNS-032對(duì)JAK/STST3途徑相關(guān)蛋白的抑制作用

8、:應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測(cè)SNS-032對(duì)JAK/STAT3蛋白表達(dá)的作用，結(jié)果顯示SNS-032顯著抑制JAK蛋白表達(dá)，抑制STAT3的磷酸化水平。此外，SNS-032對(duì)CDK下游抗凋亡蛋白Mcl-1和c-myc也有顯著的抑制作用。
　　5、(5)IL-6對(duì)SNS-032對(duì)白血病細(xì)胞作用的影響:應(yīng)用Western-blot技術(shù)，對(duì)試驗(yàn)組聯(lián)合IL-6進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)IL-6在HL-60細(xì)胞組可輕度上調(diào)JAK2和磷酸化ST

9、AT3，但不能逆轉(zhuǎn)SNS-032對(duì)其的抑制作用，但在KG-1細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)中IL-6輕度上調(diào)JAK2，明顯激活STAT3，聯(lián)合用藥后能部分逆轉(zhuǎn)對(duì)STAT3的激活作用。
　　結(jié)論：
　　1、 SNS-032對(duì)多種人AML細(xì)胞株有生長(zhǎng)抑制作用，呈時(shí)間-劑量依賴性。
　　2、 IL-6不能逆轉(zhuǎn)SNS-032對(duì)AML細(xì)胞株HL-60的生長(zhǎng)抑制作用，提示其可以克服耐藥。
　　3、新型CDK抑制劑SNS-032能誘導(dǎo)AML細(xì)胞凋

10、亡，濃度為200 nM是能顯著誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。
　　4、 SNS-032顯著下調(diào)HL-60細(xì)胞miR-30a、miR-183、miR-20b、miR-26b、miR-20a、miR-589、miR-107、miR-181a、miR-106a、miR-17和miR-378c的表達(dá)水平，顯著上調(diào)hsa-miR-320a和miR-H7*
　　5、SNS-032能顯著抑制JAK/STAT3途徑相關(guān)蛋白和CDK下游抗凋亡蛋白M