甲型H1N1流感假病毒模型的構建及應用.pdf

1、目的：本課題針對流感病毒感染宿主機體的作用機制，利用分子生物技術、細胞生物技術構建用于抗流感病毒類藥物篩選和評價的甲型H1N1流感假病毒模型，并對其應用進行探索。利用構建的流感假病毒模型系統(tǒng)評價流感免疫血清的中和效價、評價帕拉米韋氯化鈉注射液和板藍根藥材提取液的抗流感病毒活性，從而為該類藥物的研發(fā)建立了安全、有效的抗流感病毒檢測方法。
　　方法：
　　方法一：甲型H1N1流感假病毒模型的構建
　　1、重組表達質(zhì)粒的構建

2、：選擇H1N1流感病毒亞型A/California/04/2009為模板，合成相應的血球凝集素(hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA)全長cDNA序列，通過酶切和連接反應與pcDNA3.1+載體合成重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后進行重組表達質(zhì)粒的擴增，采用測序、酶切及PCR等方法鑒定重組表達質(zhì)粒構建成功。
　　2、甲型H1N1流感假病毒制備：將pNL4-3.Luc.R-E-（簡稱pNL，下同）

3、與重組表達質(zhì)粒（HA與NA）或VSV-G（Vesicular Stomatitis Virus G，水皰性口炎病毒G蛋白）質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至包裝細胞，取細胞上清，過濾后即得甲型H1N1流感假病毒和 VSV-G假病毒。將獲得的流感假病毒感染宿主細胞，檢測宿主細胞內(nèi)的熒光值。
　　1）包裝細胞的篩選:將pNL與HA、NA或VSV-G分別轉(zhuǎn)染pheonix293細胞、293FT細胞和293T細胞后，通過檢測轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)熒光強度篩選適用于本研究

4、實驗體系的包裝細胞。
　　2）宿主細胞的篩選:將獲得的流感假病毒感染MDCK細胞、A549細胞、293T細胞和HEK293細胞，通過檢測被感染細胞內(nèi)熒光強度篩選適用于本研究實驗體系的宿主細胞。
　　3、流感假病毒模型驗證：將獲得流感假病毒感染 HEK293宿主細胞，通過檢測宿主細胞內(nèi)熒光強度評價流感假病毒的感染活性。用WHO推薦抗流感病毒藥奧司他韋及奧司他韋酸作為陽性藥物，評價所構建的流感假病毒模型，證明流感假病毒模型構建成

5、功。
　　方法二：甲型H1N1流感假病毒模型的應用
　　1、流感免疫血清中和效價評價：將流感假病毒與不同稀釋比例流感病毒免疫血清（Influenza Anti-A/California/7/2009 HA Serum Sheep535，536，537，538）作用后，感染HEK293宿主細胞，通過檢測宿主細胞內(nèi)熒光強度評價免疫血清的中和效價。
　　2、化學藥物帕拉米韋抗病毒活性評價：依據(jù)帕拉米韋抗流感病毒作用機制，在假

6、病毒生成階段加入帕拉米韋，獲得假病毒后，感染HEK293宿主細胞，通過檢測宿主細胞熒光強度評價帕拉米韋對流感假病毒的抑制作用。
　　3、中藥板藍根抗病毒活性評價：將流感假病毒與板藍根藥材提取液作用后，感染HEK293宿主細胞，通過檢測宿主細胞熒光強度評價板藍根藥材提取液對假病毒的抑制作用。另外，通過經(jīng)典雞胚尿囊膜實驗和NA酶活檢測實驗評價板藍根藥材提取液的抗流感病毒活性，與假病毒方法比較，進一步驗證該方法在中藥抗流感病毒藥效中的作

7、用。
　　結果：
　　結果一：甲型H1N1流感假病毒模型的構建
　　1、轉(zhuǎn)化后提取的重組表達質(zhì)粒的酶切與PCR產(chǎn)物電泳條帶在同一位置，目的條帶的大小與預期條帶大小一致，測序結果也與GenBank目的基因一致，證明重組表達質(zhì)粒構建成功。
　　2、3株包裝細胞（293T細胞、pheonix293細胞和293FT細胞）的胞內(nèi)熒光值檢測結果顯示，293T包裝細胞內(nèi)的相對熒光素酶活性（Relative Luciferase

8、 Activity， RLA）值比pheonix293細胞和293FT細胞的RLA值高，包裝效率最高，確定293T細胞作為本研究實驗體系的包裝細胞。4株宿主細胞（293T細胞、MDCK細胞、A549細胞及HEK293細胞）的胞內(nèi)熒光值檢測結果顯示，HEK293細胞的RLA值比293T細胞、MDCK細胞和A549細胞的RLA值高，易感性最好，確定HEK293細胞作為本研究實驗體系的宿主細胞。同時，感染結果表明制備的假病毒具有感染流感易感細

9、胞的能力（實驗組RLA值和陰性對照組RLA值在統(tǒng)計學上具有顯著性差異）。
　　3、陽性藥物評價實驗的結果顯示奧司他韋和奧司他韋酸對制備的流感假病毒的抑制率有劑量的依賴性，在1.00×10-10mol/L～1.00×10-5mol/L的劑量范圍內(nèi)，藥物濃度與流感假病毒抑制率呈正相關，與病毒釋放量呈負相關。奧司他韋和奧司他韋酸對假病毒模型的IC50分別為1.07×10-8mol/L和1.82×10-9mol/L，證明流感假病毒模型構建

10、成功。
　　結果二：甲型H1N1流感假病毒模型的應用
　　1、血清中和實驗結果顯示制備的假病毒能夠與甲型 H1N1流感病毒免疫血清發(fā)生中和作用，免疫血清的IC50在1:320～1:640之間，而對VSV-G假病毒基本無中和能力，證明制備的流感假病毒具有與流感病毒相似的生物學功能，該假病毒模型可用于流感病毒免疫血清的中和效價評價。2、假病毒模型評價化學藥物帕拉米韋結果顯示，模型陽性對照組 VSV-G假病毒的抑制率不受帕拉米韋影

11、響，可以排除藥物對本模型構建實驗系統(tǒng)其他因素的影響；帕拉米韋對制備的流感假病毒的抑制率有劑量依賴性，在1.00×10-10mol/L～1.00×10-5mol/L的劑量范圍內(nèi)，藥物濃度與流感假病毒抑制率呈正相關，與病毒釋放量呈負相關。帕拉米韋對假病毒模型的IC50為2.00×10-11mol/L，該假病毒模型可用于抗流感病毒化學藥帕拉米韋的藥效評價。
　　3、通過經(jīng)典的雞胚尿囊膜實驗，將不同劑量的板藍根藥材提取液與流感病毒混合后接

12、種至雞胚，病毒活性被明顯抑制。通過NA酶活性測定實驗評價板藍根藥材提取液的抗流感病毒活性，NA酶活抑制率與板藍根藥材提取液濃度呈正相關，而抑制率轉(zhuǎn)換成幾率單位后，對數(shù)濃度與反應函數(shù)呈直線關系，回歸方程Y(幾率單位)＝6.822+1.9168×Log(濃度)，R=0.9748。板藍根藥材提取液對NA酶活具有抑制能力，量效關系呈線性關系。利用構建的流感假病毒模型評價板藍根藥材提取液的抗流感病毒活性，結果顯示板藍根藥材提取液對所制備的H1N1

13、流感假病毒具有抑制作用，且對假病毒RLA值的50％抑制濃度為10-5g/mL，而模型陽性對照組VSV-G假病毒的抑制率不受板藍根藥材提取液的影響。
　　結論：
　　1、成功構建了A/California/04/2009（H1N1）流感病毒亞型的重組表達質(zhì)粒。
　　2、確定了適用于本研究實驗體系的包裝細胞（293T）和宿主細胞（HEK293）。
　　3、成功構建了甲型H1N1流感假病毒模型，并經(jīng)陽性藥給予驗證確認。