干擾素γ對高磷誘導大鼠血管平滑肌細胞鈣化的影響研究.pdf

1、目的:慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)患者心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)發(fā)病率及死亡率較普通人群明顯升高，其主要原因可能是CVD構成了慢性腎臟病患者死亡的主要危險因素，約占總其死亡率的50％以上，更有研究表明，心血管事件中，冠狀動脈鈣化約占20％。而與傳統(tǒng)的冠脈鈣化不同，CKD患者的血管鈣化主要發(fā)生在中膜，主要由血管平滑肌構成，目前已有大量研究表明，隨著CKD患者腎功

2、能喪失，對磷清除減少，進而血清磷升高，促進了CKD血管鈣化，血清磷是促進CKD患者血管鈣化的獨立危險因素。大量基礎研究表明，高磷環(huán)境促進了血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型向成骨/成軟骨樣轉化、促使核心結合因子α1（Cbfα1）、骨形成蛋白BMP-2表達上調而誘導鈣化，高磷誘導VSMCs表型轉化是血管鈣化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，同時還涉及凋亡等其他多種因素，其具體機制目前仍未明確。而目前現(xiàn)

3、實中對血管鈣化的預防與治療方面尚無行之有效的方法及措施。研究顯示干擾素γ對成骨細胞和破骨細胞的生成有一定的調節(jié)作用，而VSMCs發(fā)生表型轉化的過程恰恰與此過程相似。本研究旨在研究高磷誘導血管鈣化的基礎上增加干擾素γ，觀察干擾素γ能否抑制或減輕血管鈣化程度。
　　方法:
　　1、采取大鼠主動脈組織塊貼壁法原代培養(yǎng)并獲取VSMCs，并應用形態(tài)學及細胞免疫學的方法對VSMCs進行鑒定。
　　2、實驗分組及干預處理:將VSMC

4、s應用隨機分組方法分為陰性對照組、高磷組及干擾素γ干預組，陰性對照組采用低糖的DMEM加10％胎牛血清作為正常培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，高磷組是在正常培養(yǎng)基的基礎上加入濃度為10 mmol/Lβ-甘油磷酸配制成的高磷培養(yǎng)基培養(yǎng)，干擾素γ干預組在上述高磷培養(yǎng)基的基礎上加入干擾素γ，使干擾素γ的最終濃度為100u/mL，各組共刺激VSMCs共3d。
　　3、鈣化檢測:各組VSMCs培養(yǎng)14d后分別用茜素紅(Alizarin red stain)

5、鈣化染色和比色法測定細胞的鈣含量。
　　4、堿性磷酸酶(ALP)活性測定:取3～4代細胞接種于6孔板，細胞密度大約為2×105/孔，干預時間為7d，棄去培養(yǎng)基，PBS液洗滌細胞2-3次，每孔加入500μL0.1％TritonⅩ～100置于4℃環(huán)境中約12～24 h，然后反復吹打裂解細胞，并置于離心管中離心，應用化學發(fā)光法檢測ALP的活性。
　　5、采用RT-PCR方法研究高磷、干擾素γ干預組對VSMCs中Cbfα1、BMP-

6、2、Smad1、Smad7 mRNA水平表達的影響。
　　6、蛋白印跡法檢測:取干預3d的各組細胞，按照常規(guī)方法提取蛋白質并用BCA試劑盒進行蛋白定量，十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉膜、封閉，加一抗(B-actin1∶1000，Cbfα11∶500)稀釋液，4℃孵育過夜。洗膜3次后加入熒光二抗稀釋液(1∶2000)，室溫下孵育2h，用免疫熒光成像系統(tǒng)顯色，應用圖像分析軟件對條帶進行掃描并測得灰度值，

7、計算蛋白表達量，實驗共重復3次。
　　7、統(tǒng)計學方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差((x)±s)表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），不符合正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)表示，用秩和檢驗進行多組間比較，用S-N-K檢驗(student-Newman-Keuls，SNK)作多組間均數(shù)兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　

8、　結果:
　　1、VSMCs原代培養(yǎng):采用組織塊貼壁法獲取原代SD大鼠VSMCs，正常情況下組織塊開始貼壁約3-4d后即可見少量細胞沿組織邊緣爬出，形狀呈長梭形，分散束狀排列，細胞數(shù)量隨著時間延長而逐漸增多，約培養(yǎng)6-7 d后細胞可長滿瓶底面積的70％左右。細胞數(shù)量約占瓶底面積80-90％即可傳代，傳代后由于胰酶的消化作用，細胞起初并未貼壁，而是呈現(xiàn)圓形或橢圓形漂浮于瓶底，逐漸貼壁后右可恢復成長梭形，胞漿飽滿豐富，胞核為卵圓形或橢

9、圓形，可見細胞交互生長，鏡下可見典型的“峰-谷”現(xiàn)象。用免疫細胞化學法對平滑肌細胞進行特異性抗體檢測，即α-平滑肌肌動蛋白抗體(α-SMA actin)進行檢測，胞漿α-SMA actin若出現(xiàn)強表達，或見到棕黃色免疫反應產(chǎn)物，則可判定為是平滑肌細胞。
　　2、茜素紅鈣化染色結果顯示:高磷組、干擾素γ干預組與陰性對照組相比，2組中VSMCs鈣化染色均有不同程度的加重，而干擾素γ干預組與高磷組比較，鈣化染色程度呈現(xiàn)顯著降低。

10、　　3、鈣含量檢測結果顯示:與陰性對照組相比，高磷組及干擾素γ干預組刺激VSMCs后，鈣含量均顯著增加，干擾素γ干預組與高磷組相比，鈣含量明顯降低，其各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4、ALP活性測定結果:與陰性對照組相比，高磷組及干擾素γ干預組VSMCs的ALP水平均有不同程度地升高。干擾素γ干預組與高磷組比較，干擾素γ干預組ALP活性降低。
　　5、RT-PCR檢測各組VSMCs中Cbfα1、BMP-

11、2、Smad1、Smad7 mRNA的表達結果顯示:與陰性對照組相比，高磷組及干擾素γ干預組的VSMCsCbfα1、BMP-2、Smad1mRNA水平均不同程度地增加，而Smad7 mRNA有所下降，干擾素γ干預組與高磷組比較，Cbfα1 BMP-2、Smad1mRNA水平也有所下降，Smad7 mRNA水平有所上升，各組間比較均有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　1、本課題采用SD大鼠胸主動脈組織塊貼壁法成功地培養(yǎng)了原代VSM