MicroRNA-23b調(diào)節(jié)膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)及在膿毒癥患者外周血白細(xì)胞的表達(dá).pdf

1、本文分兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 microRNA-23b調(diào)節(jié)膿毒癥臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)
　　通過(guò)細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，然后轉(zhuǎn)染mir-23b的模仿劑或者抑制劑進(jìn)入細(xì)胞，并觀察轉(zhuǎn)染對(duì)mir-23b表達(dá)的上調(diào)和抑制作用，對(duì)膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的炎癥調(diào)節(jié)因子的影響。進(jìn)而探討mir-23b作為膿毒癥的靶點(diǎn)以及生物標(biāo)志物的可能性。
　　方法:
　　mir-23b抑制

2、劑和模擬劑分別被轉(zhuǎn)染到人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)從而分別抑制和上調(diào)mir-23b表達(dá)。抑制劑和模擬劑的陰性對(duì)照(NC)同樣進(jìn)行轉(zhuǎn)染以便對(duì)照。觀察LPS刺激后4h和8h后各組細(xì)胞NF-κB、TNF-α、IL-6、E選擇素、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表達(dá)和mRNA的表達(dá)，以及miR-23b表達(dá)的熒光圖片，進(jìn)行分析和比較。組間行x2檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)，SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為有顯著差異。
　　結(jié)果:

3、　　1、轉(zhuǎn)染mir-23b抑制劑抑制了人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞中的mir-23b的表達(dá);轉(zhuǎn)染模擬劑則可促進(jìn)mir-23b的表達(dá)
　　使用熒光顯微鏡可見(jiàn)人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞中，mir-23b發(fā)出綠色熒光。而定量PCR的結(jié)果則表明，mir-23b抑制劑的轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組及NC組相比較，其mir-23b的表達(dá)可見(jiàn)顯著的降低，表明mir-23b抑制劑的轉(zhuǎn)染抑制mir-23b的表達(dá)有效。與此相反，mir-23b模擬劑的轉(zhuǎn)染組與空白組和NC組的模擬

4、劑組相比，則發(fā)現(xiàn)mir-23b的表達(dá)增高，表明mir-23b模擬劑的轉(zhuǎn)染可促進(jìn)mir-23b表達(dá)。
　　2、LPS下調(diào)入臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞中mir-23b的表達(dá)
　　LPS刺激的人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞模擬膿毒癥中血管內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)果顯示，相比沒(méi)有用LPS刺激細(xì)胞表達(dá)的miR-23b，轉(zhuǎn)染顯著模擬劑對(duì)照和拮抗劑對(duì)照的細(xì)胞LPS刺激4h或8h后的miR-23b表達(dá)明顯下降(P＜0.01)。結(jié)果表明，在LPS刺激導(dǎo)致人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞的m

5、ir-23b表達(dá)減少，在膿毒癥中血管內(nèi)皮細(xì)胞活化伴有mir-23b表達(dá)的抑制。相反，在模擬劑轉(zhuǎn)染組與沒(méi)有LPS刺激的細(xì)胞相比較，LPS刺激后4h、8h檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，mir-23b表達(dá)輕微下降，但仍處于高水平。在抑制劑的轉(zhuǎn)染組中，LPS刺激后內(nèi)皮細(xì)胞所表達(dá)的mir-23b則仍然很低。
　　3、LPS促進(jìn)炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　LPS刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)后4h、8h檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，炎性因子NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1，

6、VCAM-1和E-選擇素E均顯著增加(P＜0.05)，表明LPS刺激的人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而導(dǎo)致膿毒癥中的炎癥反應(yīng)。
　　4、mir-23b模擬劑抑制LPS刺激后炎癥因子的表達(dá)
　　LPS刺激人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞4h、8h在轉(zhuǎn)染模擬NC組的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1， VCAM-1和E-選擇素mRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，與轉(zhuǎn)染模擬劑組有明顯差異(P＜0.05)。Western b

7、lot分析結(jié)果表明，LPS刺激后4h檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模擬劑轉(zhuǎn)染組的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1和E-選擇素的蛋白水平，明顯低于模擬劑NC組4h(P＜0.05)。LPS刺激后8h檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，VCAM-1的蛋白水平在模擬劑的轉(zhuǎn)染組顯著的低于模仿劑NC的轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)。
　　5、mir-23b抑制劑的轉(zhuǎn)染對(duì)LPS刺激以后細(xì)胞的炎癥因子的表達(dá)產(chǎn)生影響
　　抑制劑NC轉(zhuǎn)染組LPS刺激4h、8h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其N(xiāo)F-κB

8、，IL-6，ICAM-1，VCAM-1和選擇素E的表達(dá)，比其刺激以前的水平有顯著的增加(P＜0.05)。這些炎性因子的表達(dá)水平在抑制劑轉(zhuǎn)染組LPS刺激后與刺激前比較，也明顯升高(P＜0.05)。此外，抑制劑轉(zhuǎn)染組與抑制劑NC轉(zhuǎn)染組比較，LPS刺激后4h、8h后炎性因子水平顯著升高。Western blot分析表明，與抑制劑NC轉(zhuǎn)染組比較，LPS刺激后4h、8h抑制劑轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1，E選擇素和V

9、CAM-1蛋白表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　LPS刺激后內(nèi)皮細(xì)胞的miR-23b表達(dá)下降，而轉(zhuǎn)染miR-23b模擬劑后，LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后NF-κB，IL-6，ICAM-1，VCAM-1，選擇素E的表達(dá)下降，而轉(zhuǎn)染miR-23b抑制劑后，LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1、選擇素E的表達(dá)上調(diào)。以往研究表明，這些炎性因子均是膿毒癥炎癥網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(inflamm

10、atorynetwork)的重要組成因子，在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用。因而我們認(rèn)為，miR-23b可以通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-6、E選擇素、ICAM-1、VCAM-1的釋放，進(jìn)而對(duì)膿毒癥進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　第二部分 microRNA-23b在膿毒癥患者外周血的表達(dá)
　　收集樣本外周血取自20例膿毒癥患者、10例SIRS患者及10例正常對(duì)照組人群，記錄相關(guān)的臨床資料，并采用mirVana

11、 PARIS Kit方法進(jìn)行樣本外周血的血清中RNA抽提，然后使用AllinOne的miRNA qRT-PCR法對(duì)miRNA-23b在血清中的相對(duì)定量進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)測(cè)定血中WBC計(jì)數(shù)、血清TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α比值的變化，并結(jié)合患者的臨床資料測(cè)定SOFA評(píng)分，比較膿毒癥、SIRS及正常對(duì)照組血清中miRNA-23b表達(dá)的差異，分析血清miRNA-23b的表達(dá)與膿毒癥患者SOFA評(píng)分、WBC計(jì)數(shù)、血清TNF-α

12、、IL-10水平及IL-10/TNF-α比值的關(guān)系，并分析膿毒癥死亡組與存活組之間的差異，從而判定其與臨床指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性。
　　結(jié)果
　　1、miR-23b的檢測(cè)靈敏度以及線性范圍
　　miR-23b和U6檢測(cè)的最低檢出界限為6.97 pg/μL RNA，在6.97～6.97×104pμL的RNA范圍內(nèi)miR-23b和U6測(cè)定的Ct值與RNA濃度之間存在良好的線性相關(guān)關(guān)系(r＞0.999)。
　　2、外周血中

13、miR-23b的溫度穩(wěn)定性
　　在4℃保存外周血循環(huán)血，1、3及5d后，其總定量RNA從51.32 ng/μL下降至18.3 ng/μL，由此可見(jiàn)總RNA的降解隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)同步增多。而外周循環(huán)血的白細(xì)胞中miR-23b和U6的表達(dá)水平則沒(méi)有明顯變化。
　　3、膿毒癥患者病情分析
　　20例膿毒癥患者中病情分布為:心內(nèi)膜炎患者2例，膽道感染患者2例，腹膜炎患者4例，肺部感染患者12例。28 d病死率為20％(4/20

14、); SOFA評(píng)分2～11分，平均（5.8±2.52）分。
　　4、外周血中miR-23b、WBC、血清中TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α的比值變化
　　與對(duì)照組相比較，膿毒癥組對(duì)象的miR-23b表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，同時(shí)其血液中的WBC、IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值均顯著升高(P＜0.01);而膿毒癥組與SIRS組之間比較，各項(xiàng)指標(biāo)均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

15、
　　5、預(yù)后不同，膿毒癥病患組內(nèi)miR-23b、血清中IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值之間的差異
　　膿毒癥患者組中死亡患者與存活患者相比較，miR-23b表達(dá)量明顯降低(P=0.003，P＜0.01)，而血清中IL-10的水平則明顯升高(P=0.037，P＜0.01)。兩組患者的組間白細(xì)胞數(shù)(P=0.584)，血清中TNF-α水平(P=0.324)以及IL-10和TNF-α的比值(P=0.263

16、)均沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　6、膿毒癥患者的miR-23b水平與其自身的WBC、血清中TNF-α、IL-10的水平以及SOFA評(píng)分之間的關(guān)系
　　膿毒癥患者外周血miR-23b表達(dá)所需的循環(huán)數(shù)與其自身的SOFA評(píng)分、血清中的TNF-α和IL-10呈顯著相關(guān)（其r值分別為0.473、0.485和0.470，P＜0.05）;其與WBC計(jì)數(shù)（r值分別為0.301）以及IL-10和TNF-α的比值均無(wú)明顯相關(guān)(r

17、值為0.039，P＞0.05)。
　　7、IL-10、TNF-α在膿毒癥組病患的表達(dá)水平及兩者的比值和SOFA評(píng)分之間的關(guān)系
　　膿毒癥患者的SOFA評(píng)分與血清中的IL-10(r值為0.369)、TNF-α(r值為0.410)和IL-10與TNF-α的比值(r值分別為0.124)均無(wú)明顯的相關(guān)性(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　miRNA-23b的表達(dá)水平在膿毒癥組患者較正常對(duì)照組明顯下降，但與SIRS組患者相