細胞-微粒皮法修復深度創(chuàng)面的實驗研究.pdf

1、目的:
　　研究表皮細胞與自體微粒皮聯(lián)合修復深度創(chuàng)面的效果，為救治大面積深度燒傷患者，促進創(chuàng)面的修復提供實驗基礎。
　　方法:
　　1.表皮細胞的分離培養(yǎng)與功能表皮細胞的構建
　　取新鮮人體包皮組織，通過兩步酶消化法分離得到表皮細胞，傳代培養(yǎng)。
　　(1)最佳病毒感染復數(shù)的測定:將攜帶EGF基因和GFP基因的腺病毒(Ad-hEGF)以不同感染復數(shù)(MOI值分別為0，5，20，50，100，150，200)轉

2、染表皮細胞。轉染后24、48、72 h，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光表達，流式細胞儀檢測轉染率，ELISA法檢測收集的細胞上清液中EGF濃度，CCK-8法檢測細胞的增殖率，確定最佳的病毒感染復數(shù)。
　　(2)轉染后細胞分泌EGF生物活性的檢測:將細胞分為未轉染組（對照組）和轉染組。對照組用未轉染的表皮細胞培養(yǎng)上清液孵育，轉染組用最佳MOI值(50) Ad-hEGF轉染后的表皮細胞培養(yǎng)上清液孵育，分

3、別于孵育后1、3、5d，CCK-8法檢測兩組細胞的增殖率。
　　(3)轉染后細胞分化相關標志物表達的檢測:將細胞分為未轉染組（對照組）和轉染組。對照組不加Ad-hEGF，轉染組用最佳MOI值(50)Ad-hEGF轉染表皮細胞。培養(yǎng)24 h后，免疫熒光染色法檢測表皮細胞分化相關標志物CK14、CK19表達。
　　(4)轉染后細胞遷移能力的檢測:將細胞分為未轉染組（對照組）和轉染組。對照組不加Ad-hEGF，轉染組用最佳MOI值

4、(50) Ad-hEGF轉染表皮細胞。于劃痕后0、12、24、48 h，倒置相差顯微鏡下觀察細胞遷移情況。
　　2.細胞-微粒皮法修復大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面的實驗研究
　　取健康清潔級成年SD大鼠70只，體質量210～230 g，采用隨機數(shù)字表法分為7組，每組10只，Ⅰ組:微粒皮(1∶10)移植組，Ⅱ組:微粒皮(1∶20)移植組，Ⅲ組:微粒皮(1∶20)+普通表皮細胞移植組，Ⅳ組:微粒皮(1∶20)+EGF高表達的表皮細胞移植

5、組，Ⅴ組:普通表皮細胞移植組，Ⅵ組:EGF高表達的表皮細胞移植組，Ⅶ組:對照組。35只Wistar大鼠用于制備異體中厚皮，同時將70只SD大鼠背部制作大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面抗攣縮模型。將各組移植物分別移植到相應創(chuàng)面，各組均覆蓋由成年Wistar大鼠背部皮膚制備的同種異體中厚皮。
　　(1)創(chuàng)面大體觀察及愈合率的測定:術后觀察大鼠存活情況;術后7d、14d、21d觀察各組大鼠背部同種異體皮成活、脫落及刨面愈合情況，同種異體皮脫落后計算

6、創(chuàng)面愈合率。
　　(2)創(chuàng)面組織學的檢測:術后21 d時取材行組織學及免疫組織化學染色，觀察創(chuàng)面修復情況。
　　(3)創(chuàng)面組織中EGF mRNA水平的檢測:術后7d、14d、21 d創(chuàng)面取材行Real-time PCR分析創(chuàng)面組織中EGF mRNA水平。
　　結果:
　　1.表皮細胞的分離培養(yǎng)與功能表皮細胞的構建
　　(1)最佳病毒感染復數(shù)的測定:轉染后24、48 h，各組表皮細胞形態(tài)比較無明顯改變，均呈小

7、的多角形，胞體透亮，細胞核居中較大。轉染后72h，MOI=200轉染組的細胞碎片較其他組明顯增多。對照組表皮細胞未見綠色熒光蛋白表達，而各轉染組表皮細胞可見綠色熒光蛋白表達。轉染后72h，MOI=50，100，150，200轉染組表皮細胞轉染率均大于90％，對照組及MOI=5，20轉染組表皮細胞的轉染率分別為（0.51±0.20）％、（62.44±6.23）％、（75.00±5.43）％，明顯低于MOI=50轉染組的(93.12±2.5

8、5)％(P值均小于0.01)。隨著轉染時間的延長，各轉染組表皮細胞上清液中EGF濃度逐漸增高。轉染后72 h，MOI=50轉染組表皮細胞上清液中EGF濃度明顯高于其余各組(P值均小于0.01)。轉染后24、48 h，各組表皮細胞增殖率相近（P值均大于0.05）。轉染后72 h，MOI=200轉染組表皮細胞增殖率明顯低于其余各組（P值均小于0.05）。
　　(2)轉染后細胞分泌EGF生物活性的檢測:孵育后1d，轉染組與對照組表皮細胞

9、的增殖率相近(P＞0.05)。孵育后3、5d，轉染組表皮細胞增殖率分別為1.10±0.11、1.87±0.21，明顯高于對照組的0.69±0.09、0.82±0.08(P值均小于0.01)。
　　(3)轉染后細胞分化相關標志物表達的檢測:轉染后24 h,轉染組表皮細胞分化相關標志物CK14、CK19表達較對照組增強。
　　(4)轉染后細胞遷移能力的檢測:劃痕后48 h，轉染組細胞已基本爬滿劃痕，對照組細胞仍未爬行至劃痕中心。

10、劃痕后12～48 h，2組細胞遷移距離比較，差異有統(tǒng)計學意義（P值均小于0.01）。
　　2.細胞-微粒皮法修復大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面的實驗研究
　　(1)創(chuàng)面大體觀察及愈合率的測定:術后大鼠均存活至實驗完成。術后各組大鼠同種異體皮隨時間延長逐漸成活，干燥并開始脫痂，至同種異體皮基本脫落后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組創(chuàng)面可見成片上皮，Ⅴ組創(chuàng)面可見菲薄上皮，Ⅵ組殘留大部分創(chuàng)面，Ⅶ組創(chuàng)面無上皮形成。同種異體皮脫落后（術后21 d時），Ⅰ、Ⅱ、

11、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組創(chuàng)面愈合率分別為83.2％±5.6％、66.0％±6.0％、73.6％±5.3％、83.7％±4.3％、36.5％±6.1％、66.5％±5.1％、22.7％±5.5％，Ⅰ、Ⅳ組創(chuàng)面愈合率顯著高于其余各組(P＜0.01)，Ⅲ組創(chuàng)面愈合率高于Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組(P＜0.05)，Ⅱ、Ⅵ組創(chuàng)面愈合率高于Ⅴ、Ⅶ組(P＜0.01)，Ⅴ組創(chuàng)面愈合率高于Ⅶ組，比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);Ⅰ、Ⅳ組間創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計學

12、意義（P＞0.05），Ⅱ、Ⅵ組間創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　(2)創(chuàng)面組織學的檢測:組織學觀察，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組創(chuàng)面上皮分層明顯，表皮層較厚，基底層呈柱狀排列，Ⅴ、Ⅵ組創(chuàng)面可見表皮層含有較多空泡，且細胞排列疏松，Ⅶ組為肉茅組織。免疫組織化學染色觀察，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組表皮-真皮連接層的Ⅳ型膠原表達呈陽性,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組表皮-真皮連接層的層黏連蛋白表達呈陽性，Ⅶ組均呈陰性。
　　(3)創(chuàng)面組織

13、中EGF mRNA水平的檢測:術后7d和14d，Ⅳ和Ⅵ組的EGF mRNA表達水平顯著高于其他組（P＜0.01）。術后21 d，EGFmRNA的表達在所有組幾乎檢測不到。
　　結論:
　　1.Ad-hEGF轉染表皮細胞的合適MOI值為50～150，以50為最佳，既能高效表達目的基因，又可保持良好的細胞生物學特性。
　　2.普通表皮細胞與自體微粒皮聯(lián)合移植可提高創(chuàng)面愈合率，提升自體皮修復大創(chuàng)面的效率，減少自體皮的使用，為